顏 亮，昝嘉偉，馮遵永，馬金珠，徐 蕾,王 毅

(1皖南醫(yī)學(xué)院活性生物大分子安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蕪湖 241002；2安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蕪湖 241002；3南京大學(xué)化工學(xué)院江蘇省先進(jìn)有機(jī)材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023)

乳腺癌為女性高發(fā)、生存率低、預(yù)后差的惡性腫瘤[1]，隨著國(guó)內(nèi)乳腺癌篩查的普及，其病死率得到較為有效的控制[2]。然而對(duì)于治療而言，乳腺癌的高復(fù)發(fā)率和高轉(zhuǎn)移率仍然十分棘手[3]。MDA-MB231是高侵襲能力的腫瘤細(xì)胞模型，AKT-mTOR信號(hào)通路在MDA-MB231細(xì)胞中高度活化[4]，且AKT-mTOR信號(hào)抑制劑(如雷帕霉素)可以有效抑制MDA-MB231增殖[5-6]。針對(duì)抑制AKT-mTOR信號(hào)通路的化合物被不斷開(kāi)發(fā)出來(lái)且被用于抑制MDA-MB231細(xì)胞增殖的研究[7-8]。因此，針對(duì)AKT-mTOR信號(hào)的新型抑制劑的開(kāi)發(fā)對(duì)于乳腺癌的治療顯得十分重要和迫切。

吡咯烷衍生物由前體吡啶基-吲哚化合物在甲醇的回流混合物中與氨基酸和靛紅衍生物反應(yīng)形成的螺環(huán)氧基吲哚產(chǎn)物[9-10]，當(dāng)取代氨基酸為肌氨酸時(shí)，產(chǎn)物即為二吲哚吡啶基吡咯烷。到目前為止，關(guān)于吡咯烷的生物功能的研究還較少，如兩性吡咯烷衍生物通過(guò)上調(diào)Bcl-X的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞死亡和自噬[11]，吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidinodithiocarbamic acid allyl ester，PDTC)作為強(qiáng)抗氧化劑，廣泛用于NF-κB信號(hào)的特異性阻斷研究[12-13]。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)肌氨酸和靛紅衍生的螺環(huán)氧基吲哚產(chǎn)物表現(xiàn)出強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性表型。本研究就這一現(xiàn)象展開(kāi)研究，探索二吲哚吡啶基吡咯烷是否具備抗腫瘤活性能否成為潛在的化療藥物。

1 材 料

人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB231購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。二吲哚酮吡啶基吡咯烷(DIPRO)由南京大學(xué)化工學(xué)院合成(見(jiàn)路線1)。DMEM完全培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；CCK-8試劑盒(北京凱基生物科技有限公司)；EdU試劑盒(廣州銳博生物科技有限公司)；anti-BrdU、細(xì)胞凋亡試劑盒(美國(guó)BD公司)；LY294002(美國(guó)Medchemexpress公司)；p-AKT(Ser473)、p-AKT(Thr308)、p-p53、p-MOTR及PARP抗體(美國(guó)Cell Signal Technology公司)；GAPDH單克隆抗體及二抗(美國(guó)Santa Crus公司)。

Scheme1 Synthesis of Di-indolyl pyrrolidine (DIPRD)

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力值

細(xì)胞增殖情況用細(xì)胞將CCK-8試劑還原成黃色的甲瓚的能力來(lái)衡量。將人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB231按照每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中。用不同質(zhì)量濃度(0.001，0.01，0.1，1，10，100，1 000 mg/mL)的DIPRD處理細(xì)胞24 h后，每孔加入CCK-8試劑(2.5 mg/mL)10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定每孔的吸收度(A)，根據(jù)A計(jì)算出IC50。

2.3 DAPI/EdU檢測(cè)S期細(xì)胞數(shù)量

使用12.5,25,50 mg/mL DIPRD以及10 μmol/L LY294002孵育MDA-MB231細(xì)胞16 h后，按照每孔2×104個(gè)細(xì)胞(200 μL)接種到48孔板中，每孔加入50 μmol/L EdU培養(yǎng)基150 μL，37 ℃孵育2 h；PBS清洗細(xì)胞3次后，每孔加入含4%多聚甲醛的PBS 200 μL，室溫下孵育40 min；每孔加入2 mg/mL 甘氨酸200 μL，在脫色搖床上孵育5 min；棄溶液后，每孔加入PBS 300 μL，在脫色搖床上清洗5 min；棄PBS，每孔加入含0.5%TritonX-100的PBS 200 μL清洗1次；每孔加入Apollo染色反應(yīng)液200 μL避光孵育30 min后，再每孔加入DAPI 200 μL避光孵育30 min，使用熒光倒置顯微鏡觀察MDA-MB231細(xì)胞核形態(tài)，并對(duì)EdU陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)G1/S/G2期細(xì)胞占比

使用12.5,25,50 mg/mL DIPRD以及10 μmol/L LY294002孵育MDA-MB231細(xì)胞16 h后，按照每孔細(xì)胞數(shù)量為每毫升2×106個(gè)接種到6孔板中。使用終濃度為10 μmol/L的BrdU 37 ℃溫育30 min。以洗滌緩沖液500 μL洗滌2次。將細(xì)胞懸液重懸于含4 mol/L HCl的洗滌緩沖液0.5 mL中，室溫下孵育30 min。將細(xì)胞懸液重懸于洗滌緩沖液200 mL中并用mAb anti-BrdU 5 mL標(biāo)記。在4 ℃黑暗中孵育1 h。在緩沖液200 mL中重懸并用山羊抗小鼠FITC標(biāo)記的抗體4 mL孵育30 min。重懸于洗滌緩沖液200 mL和PI緩沖液200 mL后在4 ℃黑暗中孵育15～30 min。488 nm處進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞分組及處理同“2.4”項(xiàng)，收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS清洗2次，1 000 r/min收集各組細(xì)胞。加入結(jié)合緩沖液400 μL重懸細(xì)胞，分別加入PI 5 μL和Annexin V-FITC 5 μL染色，避光室溫孵育15 min。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)4個(gè)象限細(xì)胞數(shù)，分析細(xì)胞凋亡率，每次計(jì)數(shù)1×104個(gè)細(xì)胞。

2.6 Western blot檢測(cè)

使用12.5、25、50 mg/mL DIPRD孵育MDA-MB231細(xì)胞2 h，收集各組細(xì)胞裂解物。4 ℃，10 000 r/min離心5 min，取上清液。BCA法測(cè)定每個(gè)樣品的蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液，煮沸5 min，冷卻后，按照定量濃度，每孔上樣量為60 μg進(jìn)行上樣。經(jīng)SDS-PAGE(10%)電泳后，將蛋白全部轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將膜放入用TBST配制的5%脫脂奶封閉液中，室溫封閉1 h。然后加入按照1∶1 000稀釋的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。在用TBST清洗6次，每次5 min。加入稀釋好的二抗，室溫孵育1 h，TBST清洗6次，每次5 min。清洗好的膜放入暗盒上，正面朝上，加入顯影液，檢測(cè)蛋白條帶。

3 結(jié) 果

3.1 DIPRD對(duì)MDA-MB231細(xì)胞活力值的影響

DIPRD由南京大學(xué)化工學(xué)院合成。首先在一個(gè)大濃度范圍探索DIPRD對(duì)MDA-MB231細(xì)胞的毒性范圍，使用0.001，0.01，0.1，1，10，100，1 000 mg/mL的DIPRD孵育MDA-MB231細(xì)胞24 h，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，DIPRD對(duì)MDA-MB231細(xì)胞活力的半數(shù)抑制量(IC50)為16.12 mg/mL。此外，進(jìn)一步探索DIPRD對(duì)MDA-MB231細(xì)胞活力抑制的劑量，如圖2-A所示，DIPRD在12.5，25，50 mg/mL可以劑量依賴性抑制MDA-MB231細(xì)胞活力，因而將12.5，25，50 mg/mL 設(shè)置為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的低、中、高劑量組。

3.2 DIPRD對(duì)MDA-MB231細(xì)胞周期的影響

使用12.5，25，50 mg/mL DIPRD孵育MDA-MB231細(xì)胞16 h，使用DAPI/EdU對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，使用熒光倒置顯微鏡觀察MDA-MB231細(xì)胞核形態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2-B和2-C所示，在未處理的MDA-MB231細(xì)胞組，有近50%細(xì)胞處于EdU陽(yáng)性狀態(tài)，而當(dāng)使用不同濃度DIPRD處理細(xì)胞后，EdU陽(yáng)性細(xì)胞所占比例被顯著下調(diào)，且呈現(xiàn)劑量依賴性。這表明DIPRD減少S期細(xì)胞數(shù)量，阻滯了MDA-MB231細(xì)胞的細(xì)胞周期。使用BrdU-FITC和PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行孵育，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)G1/S/G2期細(xì)胞比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2-D所示，G1/G2期的細(xì)胞沒(méi)有新合成DNA其BrdU信號(hào)為陰性，而PI的熒光強(qiáng)度是G2期的二分之一。S期是正在合成DNA其BrdU為陽(yáng)性。DIPRD可以劑量依賴性的增加G1期并減少G2/S期細(xì)胞數(shù)量，表明DIPRD將MDA-MB231細(xì)胞阻滯在G1期。此外，AKT激酶特異性抑制劑LY294002同樣可以將MDA-MB231細(xì)胞阻滯在G1期，這表明AKT信號(hào)在DIPRD誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯中起重要作用。

A and B：Quantitative analysis；C:Representative images；D：Flow cytometry**P<0.01vscontrol group

3.3 DIPRD對(duì)MDA-MB231細(xì)胞凋亡影響

使用12.5，25，50 mg/mL DIPRD孵育MDA-MB231細(xì)胞16 h。使用Annexin V-FITC和PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行孵育，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞情況。結(jié)果如圖3所示，在空白對(duì)照組和AKT激酶特異性抑制劑LY294002對(duì)照組，細(xì)胞凋亡率分別為6.3%和65.8%，而用12.5 mg/mL DIPRD處理16 h 后，細(xì)胞凋亡率增加到40.1%，隨著DIPRD濃度的升高，50 mg/mL 組細(xì)胞凋亡率為68.4%。以上結(jié)果表明，DIPRD誘導(dǎo)了乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231的凋亡。

3.4 DIPRD對(duì)MDA-MB231細(xì)胞AKT-mTOR信號(hào)及MDM2/p53活性的影響

使用12.5、25、50 mg/mL DIPRD孵育MDA-MB231細(xì)胞2 h，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)磷酸化AKT和磷酸化mTOR的水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4-A所示，隨著DIPRD濃度的升高，mTOR和AKT(S473)的磷酸化水平被顯著抑制，而AKT(T308)的磷酸化水平卻提高，且總AKT表達(dá)量并沒(méi)有發(fā)生變化。此外，使用AKT抑制劑可以抑制mTOR和AKT(S473 和Thr308)的磷酸化水平。使用12.5、25、50 mg/mL DIPRD孵育MDA-MB231細(xì)胞16 h，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)磷酸化MDM2和磷酸化p53以及DNA修復(fù)酶PARP的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4-B所示，可以誘導(dǎo)MDM2磷酸化水平升高，MDM2依賴性的p53磷酸化水平被抑制，以及切割失活的PARP表達(dá)增多；本研究也檢測(cè)了細(xì)胞周期蛋白D1及細(xì)胞周期蛋白激酶CDK4的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4-C所示，Cyclin D1及CDK4的表達(dá)水平被抑制。這些實(shí)驗(yàn)表明，DIPRD可以抑制調(diào)控生存的AKT-mTOR信號(hào)并激活MDM2/p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。

**P<0.01vscontrol group

A:Effect of DIPRD on the AKT-mTOR signaling pathway；B:Effect of DIPRD on the expression of p53 of MDA-MB231 cells；C:Effect of DIPRD on the expression of Cyclin D1 of MDA-MB231 cells**P<0.01vscontrol group

4 討 論

PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在調(diào)控生理性[14]和病理性[15]細(xì)胞增殖和存活過(guò)程中至關(guān)重要。激素[16]、生長(zhǎng)因子[17]和有絲分裂原(mitogen)[18]通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面G蛋白耦聯(lián)受體(G protein-coupled receptor，GPCR)[19]，細(xì)胞因子受體[17]或者受體酪氨酸激酶受體[20]觸發(fā)質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰肌醇激酶(PI3K-phosphoinositide 3-kinase，PI3K)產(chǎn)生PIP3，PIP3通過(guò)PH結(jié)構(gòu)域招募Aak，使其雙重磷酸化[21]?；罨腁KT為絲氨酸/蘇氨酸激酶[22]，具有廣泛的的生理學(xué)效應(yīng)，調(diào)控諸如細(xì)胞存活、增殖、生長(zhǎng)和糖原代謝等重要的生理功能[23]。因此，開(kāi)發(fā)出特異性的針對(duì)PI3K-AKT的信號(hào)靶點(diǎn)抑制劑，抑制PI3K-AKT介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物的研究策略對(duì)于腫瘤的治療具有廣闊前景。鄒雪玲等[7]研究發(fā)現(xiàn)，草酸青霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離并人工合成了一個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的噻唑化合物，能夠通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制MDA-MB231乳腺癌細(xì)胞的增殖。而吡咯烷衍生物在乳腺癌細(xì)胞中的生物功能的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)人工合成的吡咯烷衍生物DIPRD具有直接的AKT磷酸化調(diào)控作用，具體表現(xiàn)為AKT的473絲氨酸殘基位點(diǎn)的抑制作用和308蘇氨酸殘基位點(diǎn)的激活作用。有研究表明，在調(diào)控細(xì)胞生存的過(guò)程中，T308的磷酸化可使AKT的活性增大100倍，但AKT的完全活化還需要疏水性的S473位點(diǎn)磷酸化，相對(duì)于AKT活性的提高而言，S473是T308磷酸化的5倍[14]。因此，對(duì)S473磷酸化位點(diǎn)的抑制可以有效抑制AKT激酶的活性。

雖然DIPRD可以激活T308的水平，然而MDA-MB231細(xì)胞的最終表型仍然表現(xiàn)為活力下降和凋亡，這表明T308的磷酸化很可能由于細(xì)胞的應(yīng)激壓力導(dǎo)致的反饋調(diào)節(jié)。AKT可以通過(guò)mTOR介導(dǎo)蛋白質(zhì)合成，并通過(guò)p70 S6激酶的信號(hào)傳導(dǎo)和4E-BP1的抑制啟動(dòng)G1細(xì)胞周期進(jìn)程來(lái)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖[24-25]。此外，AKT也可以通過(guò)抑制MDM2信號(hào)依賴性p53介導(dǎo)細(xì)胞凋亡而促進(jìn)細(xì)胞生存。MDM2是p53泛素化連接酶[26-27]，由AKT活化的MDM2會(huì)促使p53泛素化降解，從而抑制了p53依賴性的細(xì)胞凋亡[28-29]。在本項(xiàng)研究中，吡咯烷衍生物DIPRD對(duì)細(xì)胞MDA-MB231乳腺癌細(xì)胞具有直接的抑制作用，表現(xiàn)為細(xì)胞活力的直接抑制。通過(guò)EdU染色及流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在DIPRD的誘導(dǎo)下，S期細(xì)胞顯著減少，進(jìn)一步表明DIPRD抑制了MDA-MB231細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)化。此外，DIPRD可以抑制cyclin D1和CDK4的表達(dá)；并下調(diào)MDM2的磷酸化水平并使p53磷酸化釋放出來(lái)，轉(zhuǎn)位入核執(zhí)行誘導(dǎo)凋亡的功能。

總之，吡咯烷衍生物DIPRD具有良好的體外乳腺癌細(xì)胞抑制活性。此外還可作為AKT的絲氨酸殘基位點(diǎn)473的特異性抑制劑。