蔡 鳴，舒 斌*，邵 卿，袁艷娟，張玉堂，喬紅群，劉 晶

(1江蘇省藥物研究所江蘇省藥物安全性評價(jià)中心，南京 210009；2南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，南京 211816)

沃諾拉贊-(vonoprazan,商品名Takecab)是由日本武田制藥公司研制的一種新型鉀離子競爭性酸阻斷劑，為可逆性質(zhì)子泵抑制劑，2014年12月被批準(zhǔn)在日本上市，用于治療幽門螺桿菌感染、胃食管反流、消化性潰瘍、十二指腸潰瘍、食管炎、胃潰瘍等胃酸相關(guān)性疾病[1-2]。沃諾拉贊-半衰期長，抑酸作用強(qiáng)而持久，不受CYP2C19基因多態(tài)性影響，治療的個(gè)體差異小。沃諾拉贊-以富馬酸鹽形式成藥，在臨床治療腐蝕性食管炎、幽門螺旋桿菌(Hp)根除中相比蘭索拉唑表現(xiàn)出優(yōu)效，為胃酸相關(guān)疾病的患者提供了新的治療選擇[3-6]?？轮Z拉贊為沃諾拉贊-的結(jié)構(gòu)類似物，作用機(jī)制與沃諾拉贊-相似，通過抑制K+和H+-K+-ATP酶(質(zhì)子泵)結(jié)合達(dá)到抑制并提前終止胃酸分泌的目的。為評價(jià)鹽酸柯諾拉贊的藥物安全性，本研究采用大鼠進(jìn)行胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)及其伴隨毒代動(dòng)力學(xué)研究，為其后續(xù)研究和臨床試驗(yàn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

富馬酸沃諾拉贊-對照品(批號20140602，純度：99.6%，分子式C21H20FN3O6S)與鹽酸柯諾拉贊(KFP-H008，批號LF20160113，純度：99.4%，分子式C22H25FN2O4S)均由江蘇柯菲平醫(yī)藥股份有限公司提供。氯化鈉注射液為市售制劑，試驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室自制去離子水(Milli-Q制備)。

1.2 動(dòng) 物

SPF級SD大鼠，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK京2012-0001，合格證號11400700184151?！?20只，♀240只，飼養(yǎng)于江蘇省藥物安全性評價(jià)中心動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證(蘇)2016-0032。屏障環(huán)境溫度21.0～24.9 ℃，相對濕度42.1%～50.5%。

2 方 法

2.1 胚胎-胎仔發(fā)育毒性研究[7]

SD大鼠按雄雌2∶1比例合籠，每天早上對雌鼠進(jìn)行陰道涂片檢查，顯微鏡下查見精子視為交配成功，當(dāng)天定為妊娠第0天(GD 0)。交配成功者按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，每組24只，4只一籠飼養(yǎng)。參照鹽酸柯諾拉贊的大鼠經(jīng)口給藥LD50和相關(guān)指導(dǎo)原則，設(shè)低、中、高劑量(20、60、200 mg/kg)組，另設(shè)溶劑和陽性對照組(環(huán)磷酰胺)，分別連續(xù)經(jīng)口給藥10 d(GD 6～15)。于GD 0、GD 3、GD 6、GD 10、GD 13、GD 16、GD 19時(shí)稱取體質(zhì)量和加食量，次日稱取剩食量，計(jì)算攝食量。于受孕GD 20處死孕鼠，記錄黃體數(shù)、著床數(shù)、死胎數(shù)、活胎數(shù)以及活胎重量、性別、外觀異常等。將約1/2胎仔固定于Bouin氏液中做內(nèi)臟檢查，另1/2固定于70%乙醇中制作骨骼標(biāo)本后做骨骼畸形檢查。

2.2 伴隨毒代動(dòng)力學(xué)研究

在對SD大鼠進(jìn)行胚胎-胎仔發(fā)育研究時(shí)，以衛(wèi)星組的形式進(jìn)行伴隨毒代動(dòng)力學(xué)研究。鹽酸柯諾拉贊低、中、高劑量組中每組15只衛(wèi)星組孕鼠。用于血藥濃度檢測的衛(wèi)星A、B組孕鼠分別用于動(dòng)物首(單次)、末次(重復(fù))給藥時(shí)采集血樣，時(shí)間點(diǎn)依次為給藥前、給藥后10 min、30 min、1 h、2 h、4 h、7 h、10 h、24 h。采得的血樣在1 h內(nèi)以3 000 r/min，8 ℃離心10 min，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ糜诮M織分布檢測的衛(wèi)星C組孕鼠連續(xù)給藥至GD 19，并于GD 19給藥后1 h，采集血樣并快速放血處死動(dòng)物，立即剖取孕鼠的心、肝、肺、腎、胎盤，以及胎仔的心、肝、肺、腎等，用生理鹽水洗凈后轉(zhuǎn)移至聚丙烯管，保存于-20 ℃。溶劑對照組采集2只孕鼠的空白樣本。鹽酸柯諾拉贊的定量測定采用HPLC-MS/MS方法檢測。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各項(xiàng)指標(biāo)檢查結(jié)果經(jīng)SPSS 20.0軟件包統(tǒng)計(jì)處理。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié) 果

3.1 胚胎-胎仔發(fā)育毒性

給藥期間，鹽酸柯諾拉贊未對動(dòng)物的一般狀況造成明顯影響。與溶劑對照組相比，高劑量組在GD 10、GD 13、GD 16時(shí)耗食量減少明顯(表1)；同期，高、中劑量組動(dòng)物體重也明顯輕于對照(表2)。此外，高、中劑量組動(dòng)物的總增重也較明顯小于溶劑對照組(P<0.05)。

鹽酸柯諾拉贊各劑量組的活胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎數(shù)、著床數(shù)、黃體數(shù)、子宮總重、胎盤總重、性別比與溶劑對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表3。

GroupGD 0GD 3GD 6GD 10GD 13GD 16GD 19Negative con-trol20.46±5.2222.75±1.7226.04±1.6427.96±3.6528.75±4.0727.67±1.6226.96±1.56Low-dose20.89±6.5322.67±1.9324.29±0.9726.04±1.0227.04±3.1627.71±2.2625.67±1.50Medium-dose20.25±1.3822.13±1.7924.29±1.3925.21±4.7324.38±2.3727.58±2.1727.63±5.06High-dose20.26±3.9022.88±1.3919.67±4.9617.79±4.87*15.54±2.41*16.00±4.79*21.17±6.73Positive control20.97±2.9822.75±2.2123.38±2.0922.13±3.67*23.42±2.52*26.29±4.4926.63±0.95

*P<0.05vsnegative control group

GroupGD 0GD 3GD 6GD 10GD 13GD 16GD 20Weight gainsNegative control(n=23)251.00±14.23271.43±16.13288.61±18.29314.52±20.40334.52±19.64358.13±20.90413.09±24.36162.09±21.27Low-dose(n=22)250.82±11.74266.05±12.08285.27±12.43304.18±15.07320.32±19.59346.77±19.16403.00±28.12152.18±24.93Medium-dose(n=22)252.09±13.30270.32±16.46286.09±17.64300.36±22.27*318.45±23.50*338.55±28.18*392.18±40.20140.09±34.06*High-dose(n=21)246.62±8.56265.95±11.50282.43±14.27288.90±14.65*294.38±16.69*308.09±18.17*359.52±28.38*112.90±25.76*Positive control(n=23)249.96±9.27269.00±11.23286.78±11.69298.74±17.10*312.22±18.03*331.00±18.21*378.17±21.09*128.22±20.32*

*P<0.05vsnegative control group

GroupLive fetuses/dam (n)Dead fetuses/dam (n)Resorptions/dam (n)Implantation sites/dam (n)Corpora lutea/dam (n)Gravid uterus weight/gPlacentaal weight/gNegative control(n=23)13.09±3.9600.43±0.7913.52±3.8914.00±2.8478.21±19.419.05±2.67Low-dose(n=22)13.00±3.8800.41±0.7313.41±3.7214.09±2.3176.44±21.568.78±2.68Medium-dose(n=22)12.23±5.3000.91±1.6313.14±4.6014.41±2.9271.95±26.518.03±3.08High-dose(n=21)12.38±3.7501.33±2.1813.71±3.5214.43±2.7568.16±20.048.14±2.48Positive control(n=23)13.09±2.370.04±0.210.83±0.9813.96±2.2915.00±1.5162.68±9.96*5.61±1.10*

*P<0.05vsnegative control group

由表4可看出，鹽酸柯諾拉贊高劑量組動(dòng)物的胎鼠頂臀長顯著短于溶劑對照組(P<0.05)。

胎鼠內(nèi)臟檢查未見畸形發(fā)生。骨骼檢查，鹽酸柯諾拉贊高劑量組136個(gè)樣本中出現(xiàn)枕骨骨化不全8例，胸骨骨化不全86例，肋骨變異或畸形5例，四肢骨骨化不全110例；中劑量組138個(gè)樣本中出現(xiàn)枕骨骨化不全7例，肋骨變異或畸形4例，四肢骨骨化不全75例，經(jīng)χ2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與溶劑對照組相比均有顯著差異。中、低劑量組出現(xiàn)的胸骨骨化不全數(shù)量與溶劑對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表5)，說明中、高劑量的鹽酸柯諾拉贊可對胎仔的骨骼發(fā)育產(chǎn)生比較明顯的影響。

GroupSex ratio (f/m)Ccrown rump length/cmFetal weight/gNegative control(n=23)0.96±0.573.65±0.244.03±0.59Low-dose(n=22)1.54±0.773.57±0.133.84±0.25Medium-dose(n=22)1.03±0.693.62±0.323.93±0.76High-dose(n=21)1.38±0.853.44±0.18*3.66±0.36Positive control(n=23)1.40±0.973.23±0.17*3.15±0.26*

*P<0.05vsnegative control group

Table5 Skeletal alterations on fetus from pregnant rats treated with carenoprazan hydrochloride during GD 6-15

GroupNumber of fetuses (n)Parietal boneSternumRibLimb boneCoccyxNegative control1590690680Low-dose1482683760Medium-dose1387*694*75*0High-dose1368*86*5*110*0Positive control15823*154*7*143*1

*P<0.05vsnegative control group,by χ2test

3.2 伴隨毒代動(dòng)力學(xué)研究

鹽酸柯諾拉贊低(20 mg/kg)、中(60 mg/kg)劑量組首(單次)、末(多次重復(fù))次給予孕鼠口服后，測得鹽酸柯諾拉贊及其代謝產(chǎn)物達(dá)峰時(shí)間約為0.5～1 h，而高劑量(200 mg/kg)組均有所延遲，約為2 h。

由表6可看出，多次重復(fù)給藥后，中劑量組鹽酸柯諾拉贊及其代謝產(chǎn)物的AUC0-t均較首次顯著增高(P<0.05)，存在蓄積傾向；但代謝產(chǎn)物的cmax較首次明顯降低(P<0.05)。高劑量組鹽酸柯諾拉贊及其代謝產(chǎn)物在動(dòng)物體內(nèi)的暴露(cmax、AUC0-t)較首次出現(xiàn)不同程度的降低。3個(gè)劑量組末次給藥后測得鹽酸柯諾拉贊的cmax分別為首次給藥后的1.3、1.9、0.9倍，AUC0-t分別為首次的1.4、3.0、0.8倍。各劑量組末次代謝產(chǎn)物的cmax分別為首次的0.7、0.7、0.6倍，AUC0-t分別為首次的1.0、1.8、0.6倍。

在20～200 mg/kg劑量范圍內(nèi)，單次給予鹽酸柯諾拉贊的孕鼠血漿原形藥物cmax與劑量呈等比例增長，呈現(xiàn)線性動(dòng)力學(xué)特征。但其代謝產(chǎn)物則未表現(xiàn)出線性特征(表6)。此外，多次給藥后的孕鼠血漿中鹽酸柯諾拉贊及其代謝產(chǎn)物的cmax均與劑量變化不成比例，呈現(xiàn)非線性動(dòng)力學(xué)特征。單次及多次給藥后的鹽酸柯諾拉贊及其代謝產(chǎn)物的AUC0-t增長的比例均高于劑量的改變，呈現(xiàn)非線性動(dòng)力學(xué)特征。

Group Pregnant females (n)ParameterLow-dose (n=5)Medium-dose (n=5)High-dose (n=5)Drug prototypeSingle doseAUC0-t/(μg/L·h)437.5±75.01 700.2±247.213 467.1±11944.9cmax/(ng/mL)127.3±29.3359.8±141.11 043.4±882.7Repeated doseAUC0-t/(μg/L·h)621.4±250.15 145.2±1 874.1*10 199.5±3 489.8cmax/(ng/mL)167.6±124.3673.8±469.1973.6±286.5MetaboliteSingle doseAUC0-t/(μg/L·h)677.9±411.32 835.4±2 108.512 974.2±8 524.5cmax/(ng/mL)440.2±215.2907.0±114.41 366.8±1 004.7Repeated doseAUC0-t/(μg/L·h)706.5±497.55 333.9±607.9*8 164.4±2 780.9cmax/(ng/mL)319.6±236.8661.6±118.8*760.6±239.6

*P<0.05vssingle dose group

孕鼠灌胃給予鹽酸柯諾拉贊后，其在肝、肺中的含量較高，胎盤、心中含量較低，但均高于血漿。鹽酸柯諾拉贊可透過胎盤屏障進(jìn)入胎仔體內(nèi)，所測得臟器分布趨勢與母體相近，以肝含量最高、心含量最低，且均低于母體胎盤的含量(表7)。代謝產(chǎn)物的分布與原形有所不同，其在肝、腎中的含量較高；胎盤、肺、心中含量較低，且均低于血漿(表8)。各劑量組胎仔體內(nèi)的代謝產(chǎn)物分布趨勢與母體相近，肝含量最高、心含量最低，且均低于母體胎盤中的含量。

4 討 論

沃諾拉贊-的上市為治療胃酸相關(guān)性疾病提供了新的選擇，但有關(guān)其用藥安全性的報(bào)道相對較少。本研究首次報(bào)道了將較高劑量(20～200 mg/kg)的鹽酸柯諾拉贊給予懷孕動(dòng)物后的代謝情況及其對母鼠和胎鼠的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在致畸敏感期灌胃給予孕鼠60和200 mg/kg的鹽酸柯諾拉贊對母體和胎仔均產(chǎn)生了明顯的毒性反應(yīng)，而20 mg/kg劑量則未見明顯影響。

GroupLow-doseMedium-doseHigh-dosePregnant females (n)(n=4)(n=5)(n=5) MaternalPlasma (μg/mL)0.127±0.0320.264±0.1770.737±0.152Heart (μg/g)1.625±0.3313.564±1.4677.500±1.764Liver (μg/g)5.338±1.25310.860±4.44746.940±11.161Lung (μg/g)22.338±6.02637.940±9.02786.950±26.940Kidney (μg/g)3.740±1.7748.07±5.5921.12±8.58Placenta (μg/g)1.508±0.6292.97±0.8214.94±6.10 FetusHeart (μg/g)0.008±0.0150.034±0.0610.189±0.086Liver (μg/g)0.094±0.0810.285±0.2251.169±0.359Lung (μg/g)0.085±0.0500.284±0.1870.937±0.226Kidney (μg/g)0.018±0.0190.119±0.1230.307±0.253

GroupLow-doseMedium-doseHigh-dosePregnant females (n)(n=4)(n=5)(n=5) MaternalPlasma (μg/mL)0.578±0.2230.618±0.2610.800±0.191Heart (μg/g)0.490±0.0880.550±0.2680.564±0.275Liver (μg/g)9.138±2.26710.710±2.89118.480±2.913Lung (μg/g)0.718±0.2260.544±0.0430.702±0.135Kidney (μg/g)1.790±0.7132.436±1.5242.242±0.848Placenta (μg/g)0.240±0.0800.290±0.0460.470±0.185 FetusHeart (μg/g)0.013±0.0050.026±0.0070.065±0.034Liver (μg/g)0.079±0.0200.153±0.0340.409±0.149Lung (μg/g)0.028±0.0030.060±0.0110.173±0.059Kidney (μg/g)0.027±0.0070.066±0.0250.158±0.064

在進(jìn)行SD大鼠生殖毒性研究的同時(shí)，本研究以衛(wèi)星組的形式進(jìn)行伴隨的毒代動(dòng)力學(xué)研究，以觀察鹽酸柯諾拉贊在孕鼠及胎仔體內(nèi)的暴露情況，考察受試藥是否可以通過胎盤屏障，結(jié)合其毒性研究結(jié)果給予可能的解釋。沃諾拉贊-口服后能吸收迅速，主要通過肝微粒體酶CYP3A4代謝，游離堿形式在血漿中迅速消失，而在胃組織中累積，給藥24 h后在胃組織中仍然存在[8]。59%以代謝物的形式從尿液排出，僅有8%以游離堿原形從尿液排出[1]。已知的4個(gè)代謝產(chǎn)物均無藥理活性[9]。在急性肝損傷模型大鼠體內(nèi)，沃諾拉贊-暴露量AUC顯著增加，消除半衰期延長，表明急性肝損傷狀態(tài)下沃諾拉贊-在大鼠體內(nèi)的吸收和消除均受到影響[10]。由于妊娠期動(dòng)物存在生理方面的迅速變化，進(jìn)而可能引起藥物代謝動(dòng)力學(xué)的改變。參考上述數(shù)據(jù)，本研究進(jìn)行了孕鼠口服較高劑量的鹽酸柯諾拉贊后的血藥濃度檢測，發(fā)現(xiàn)藥物同樣吸收迅速，達(dá)峰時(shí)間約為0.5～1 h。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸柯諾拉贊及其代謝產(chǎn)物可透過胎盤屏障進(jìn)入胎仔體內(nèi)，且臟器分布趨勢與母體相近，均以肝中含量為最高。因此中、高劑量組出現(xiàn)的胎仔發(fā)育毒性應(yīng)與鹽酸柯諾拉贊透過胎盤屏障相關(guān)。此外，單次與多次給予鹽酸柯諾拉贊后的血藥濃度cmax變化情況有較大不同，其原因尚待進(jìn)一步的研究。