張文驥

(中國刑事警察學(xué)院，沈陽 110035)

呋喃丹(carbofuran，CAR)又名克百威，為氨基甲酸酯類殺蟲劑，屬于高毒農(nóng)藥，目前在農(nóng)業(yè)上作為玉米等多種作物的包衣種粒而廣泛使用[1]。由于獲得容易，故經(jīng)常發(fā)生中毒事件。在實(shí)際案例中，選取呋喃丹中毒的檢材及確定中毒檢材的檢測指標(biāo)是法醫(yī)學(xué)鑒定的重點(diǎn)與難點(diǎn)。研究表明，人和動物心血內(nèi)呋喃丹等氨基甲酸酯類農(nóng)藥存在死后再分布現(xiàn)象[2]，且死后存放較久的情況下不能檢出呋喃丹[3]。吳苗苗[4]研究顯示，呋喃丹在大鼠體內(nèi)可發(fā)生死后再分布，再分布與死后經(jīng)過時(shí)間、環(huán)境溫度等有關(guān)。本研究在此基礎(chǔ)上，通過對提取、檢測方法的改進(jìn)，對地呋喃丹及其主要代謝物呋喃酚(benzofuranol，BEN)在大鼠體內(nèi)死后再分布規(guī)律進(jìn)行探究，為呋喃丹中毒案件的法醫(yī)學(xué)鑒定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料

1.1 試 劑

呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)品(99.0%，國家農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心)、呋喃酚準(zhǔn)品(99.5%，上海邁瑞爾試劑)、內(nèi)標(biāo)西維因標(biāo)準(zhǔn)品(99.0%，國家農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心)；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為市售分析純；水為重蒸水。

1.2 儀 器

儀器液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀：由Thermo Finnigan液相色譜儀、Thermo Fisher LXQ離子阱質(zhì)譜儀(美國San Jose公司)組成；FSH-2A高速組織勻漿機(jī)(上海汗諾儀器有限公司)；HC-3018R 型高速冷凍離心機(jī)(河南兄弟儀器有限公司)。

1.3 動 物

Wister大鼠30只，體重(200±10)g，雌雄不限(遼寧本溪長生生物公司提供，合格證號：SCXK(遼)2015-0001)，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20 ℃，濕度40%～60%，通風(fēng)換氣良好，光照合理，喂食營養(yǎng)顆粒飼料和純凈水。本研究所進(jìn)行的動物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)符合機(jī)構(gòu)責(zé)任委員會的倫理(道德)標(biāo)準(zhǔn)，可進(jìn)行大鼠動物實(shí)驗(yàn)。

2 方 法

2.1 檢測條件

2.1.1 色譜條件 Thermo Gold ODS C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，5 μm);柱溫35 ℃；流動相為甲醇-0.1%甲酸水溶液(20∶80)；流速為0.2 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子檢測，SRM模式，掃描范圍為70～280 D；毛細(xì)管溫度為350 ℃。在上述的質(zhì)譜條件下，呋喃丹、呋喃酚和西維因主要生成[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，分別為m/z222，m/z165和m/z202。選擇性對[M+H]+進(jìn)行MS2產(chǎn)物離子全掃描質(zhì)譜分析，呋喃丹的主要碎片離子分別為m/z165和m/z122，〗呋喃酚的主要碎片離子分別為m/z123和m/z137，西維因的主要碎片離子分別為m/z145。根據(jù)其碎片離子的豐度，呋喃丹、呋喃酚、西維因定性、定量離子m/z分別為：222→165，165→123，202→145。

2.2 溶液配制

精密稱取呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)品、呋喃酚標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物西維因標(biāo)準(zhǔn)品10，10和20 mg，置于100 mL量瓶中，并加甲醇定容，分別制得呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)儲備液(100 μg/mL)、呋喃酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液(100 μg/mL)和西維因標(biāo)準(zhǔn)儲備液(200 μg/mL)。分別精密量取呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.05，0.25，0.5，2.50，5.0，25.0 mL于50 mL量瓶，加甲醇定量稀釋成質(zhì)量濃度為0.1，0.5，1.0，5.0、10.0，50.0 μg/mL的呋喃丹系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,備用。分別精密量取呋喃酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.05，0.10，0.50，1.00，5.00，25.00 mL于50 mL量瓶，加甲醇定量稀釋成質(zhì)量濃度為0.1，0.2，1.0，2.0，10.0，50.0 μg/mL的呋喃酚系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,備用。精密量取西維因準(zhǔn)儲備液1.00 mL于50 mL量瓶，加甲醇定量稀釋成質(zhì)量濃度為4.0 μg/mL 的西維因標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

2.3 樣本提取

將大鼠隨機(jī)分成6組，置于室溫(10 ℃)條件下，分別標(biāo)記為 0，12，24，48，72和96 h。稱取呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)品90 mg，磁力攪拌分散于蒸餾水50 mL中，配制成質(zhì)量濃度為1.8 mg/mL的呋喃丹混懸液。用自制呋喃丹混懸液，在攪拌狀態(tài)下抽取藥液，以4倍LD50(44 mg/kg)灌胃。待大鼠中毒死亡后，按照不同時(shí)間點(diǎn)取心血、心、肝、脾、肺、腎、腦、左下肢肌、胃及等組織，-20 ℃冰箱保存待檢。

2.4 樣本預(yù)處理

取樣品檢材1 g，剪碎，加入內(nèi)標(biāo)西維因2 μg和水2 mL，15 000 r/min勻漿3 min，再加入乙腈4 mL，振蕩渦旋，離心(3 000 r/min，10 min)，取上清液2 mL作為樣品液。氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)苡诩状?00 μL，過膜后取10 μL，按照“2.1”項(xiàng)下條件檢測，以內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

3 結(jié)果與討論

3.1 HPLC-MS/MS-MRM色譜圖和質(zhì)譜圖

呋喃丹及其代謝呋喃酚和內(nèi)標(biāo)物西維因的質(zhì)譜條件及保留時(shí)間(tR)和質(zhì)譜圖分別見表1和圖1。

Table1 MS conditions and retention time of BEN,carbaryl,and CAR

AnalyteFormulaParent ionDaughter iontR/minCARC12H15NO32221652.28BENC10H12O21651232.30CarbarylC12H11NO22021452.32

CAR：Carbofuran;BEN:Benzofuranol

Figure1 MRM chromatogram of BEN (A),carbaryl (B),and CAR (C)

3.2 工作曲線和回收率

3.2.1 工作曲線

液體檢材(方法A)：取空白血漿2.0 mL，分別添加呋喃丹、呋喃酚系列標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)西維因標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻，并按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定。

固體檢材(方法B)：取檢材組織1 g，分別添加呋喃丹、呋喃酚系列標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)西維因標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，并進(jìn)行測定。分別以血漿及肝中呋喃丹(或呋喃酚)質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),以呋喃丹(或呋喃酚)與西維因內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合，得線性方程如表2。

Table2 Standard curve of BEN and CAR in blood and liver samples

MethodAnalyteEquationrLinearity range/(μg/mL)ACAR y=0.007 9x+1.4570.999 00.1-50BENy=0.007 3x+1.8650.998 40.1-50BCAR y=0.006 8x+3.626 80.988 10.1-50BENy=0.006 3x+0.077 50.995 20.1-50

3.2.2 回收率 空白檢材中分別添加呋喃丹和呋喃酚0.1，1.0，50 μg/mL各3份，按“2.4”項(xiàng)下方法提取及檢測，工作曲線法計(jì)算呋喃丹和呋喃酚含量及回收率。血液和肝臟中添加呋喃丹及呋喃酚的提取回收率(低、中、高濃度)見表3。

c/(μg/mL)CARMethod AMethod BBENMethod AMethod B0.178.2±3.875.6±3.270.3±1.367.6±5.21.077.5±5.276.1±1.967.4±2.967.2±3.45075.8±2.873.5±2.266.4±2.565.8±3.3

3.3 死后分布

呋喃丹和呋喃酚在Wister大鼠體內(nèi)的死后分布見表4。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05)，死后0 h在大鼠體內(nèi)呋喃丹含量由高至低分布為：胃壁、肺、肝、腎、脾、左下肢肌、心、血、腦，呋喃酚含量由高至低分布為：胃壁、血、肝、腎、脾、左下肢肌、肺、腦、心。結(jié)果顯示，灌胃染毒后，呋喃丹在大鼠胃壁、肺及肝中含量較高，而呋喃酚則在大鼠胃壁、心血、肝及腎中初始含量較高，說明呋喃丹經(jīng)灌胃染毒吸收后，主要經(jīng)過肝代謝。代謝產(chǎn)物呋喃酚及原體毒物呋喃經(jīng)腎由尿液排出體外[5-6]。結(jié)果還顯示，呋喃丹在中毒死亡大鼠肺中的初始濃度較高，具有富集作用。這可能是由于流經(jīng)全身的動、靜脈血在肺中完成轉(zhuǎn)換，使肺內(nèi)部積累了大量呋喃丹造成的，這也符合肺源性的死后分布機(jī)制[7]。代謝產(chǎn)物呋喃酚在心血中初始含量較高可能是由于呋喃丹在血液中容易降解[8]，生成呋喃酚。

SpecimenDynamic distribution of CAR and BEN(μg/g)0CARBEN12CARBEN24CARBEN48CARBEN72CARBEN96 hCARBENHeart1.7±1.30.1±0.14.8±1.71.1±0.35.8±1.91.2±0.410.6±3.71.0±0.413.0±4.61.7±0.58.6±5.64.4±2.6Liver10.2±8.91.2±1.09.3±8.32.4±1.713.7±8.62.7±1.829.7±16.14.5±2.766.4±25.65.5±3.515.7±12.110.3±4.9Spleen8.7±3.80.8±0.516.6±5.92.2±1.113.0±4.81.8±0.716.5±9.23.1±1.811.5±4.11.7±1.113.9±5.05.3±2.7Lung16.7±14.30.4±0.25.6±4.90.1±0.18.3±8.00.2±0.17.2±7.00.1±0.110.0±8.8-6.7±6.1-Kidney5.7±4.71.1±0.16.6±6.30.6±0.220.0±10.23.2±0.637.3±29.65.2±1.829.4±24.07.3±2.625.1±13.19.2±1.9Brain0.9±0.70.3±0.26.5±6.20.9±0.46.8±3.21.1±0.99.7±8.11.7±1.31.5±0.60.2±0.11.2±1.00.4±0.3Stom-ach212.4±41.941.5±16.3269.4±60.032.4±22.1183.3±35.328.5±14.5118.6±57.733.9±10.584.5±41.114.7±9.0131.9±23.718.4±6.3Muscle5.4±3.80.3±0.15.1±3.9-6.4±4.30.2±0.18.0±4.20.1±0.76.8±3.00.3±0.35.8±3.3-Blood2,2±2.01.1±0.32.0±1.01.6±0.61.9±1.02.4±0.61.9±0.32.3±0.81.4±0.23.1±1.10.9±0.14.3±1.9

研究結(jié)果同時(shí)顯示，大鼠死后心血、肺、胃壁組織中呋喃丹濃度很快達(dá)到峰值，而后呈明顯下降。在大鼠死后96 h，其血、肺和胃壁中的呋喃丹濃度與0 h相比，分別降低56.13%，59.90%和37.87%；大鼠心、肝、腎和腦組織中呋喃丹濃度分別在死后72 h、72 h、48 h、48 h達(dá)到最高，與0 h 呋喃丹濃度相比分別上升7.6，6.5，6.5和10.9倍，而死后96 h與0 h呋喃丹濃度相比濃度分別上升5.1，1.5，4.4和1.3倍，呈先升高，后下降的特點(diǎn)；大鼠脾中呋喃丹濃度隨著時(shí)間的變化規(guī)律尚不規(guī)則；肌肉中呋喃丹濃度隨時(shí)間延長基本不變。以上結(jié)果表明，呋喃丹中毒死亡大鼠體內(nèi)藥物分布存在變化，由胃壁、血及肺組織，向肝、腎、心及骨骼肌組織中轉(zhuǎn)移。藥物死后分布的重要原因是組織間藥物濃度的差異[7]。胃壁組織中呋喃丹濃度隨時(shí)間明顯下降，可能由于呋喃丹在灌胃染毒致死大鼠的胃壁組織中含量較高，與相鄰的肝、腎等組織濃度梯度較大。大鼠死后，雖然藥物不能繼續(xù)通過胃壁等消化道黏膜吸收，但不同組織間殘留藥物的濃度梯度可驅(qū)使呋喃丹從濃度較高的胃壁組織遷移到毗鄰的其他組織，這樣的“死后彌散”導(dǎo)致了呋喃丹在胃組織周圍的肝、腎組織中濃度得到了上升。然而隨著死后時(shí)間的延長，肝、腎等組織內(nèi)的呋喃丹濃度并未一直升高，不同組織間的呋喃丹濃度也未得到均化，這是由于呋喃丹易于在體內(nèi)組織中發(fā)生降解生成呋喃酚，這是胃壁、心血、肺組織中呋喃丹含量隨時(shí)間明顯下降的另一個原因。心、肝、腎和腦組織中呋喃丹濃度先升后降，表明在大鼠死亡初期，由于死后彌散的存在呋喃丹的表觀降解速率受到抑制，但死后彌散可能只發(fā)生在大鼠死后的一定時(shí)間內(nèi)。心血中的呋喃丹濃度并未由于呋喃丹從毗鄰的胃壁組織的彌散而出現(xiàn)上升，說明藥物在血液中可能存在著更快的降解，這與文獻(xiàn)的報(bào)道一致[8]。同時(shí)，呋喃丹的代謝產(chǎn)物呋喃酚在死亡大鼠心、肝、脾、腎、心血中的濃度均呈上升趨勢，與0 h濃度相比分別上升31.2，8.76，6.81，8.32和3.88倍。肺及左下肢肌中呋喃酚濃度較低，且隨著時(shí)間基本保持不變。腦組織中呋喃酚含量先上升后降低。文獻(xiàn)報(bào)道，死后尸體內(nèi)的呋喃丹可繼續(xù)降解，生成呋喃酚[4]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這一結(jié)論，同時(shí)也表明呋喃丹在心、肝、腎和腦組織中后期的含量下降可能主要由于呋喃丹的降解。以上結(jié)果表明，呋喃酚在上述檢材中含量的增加受死后再分布及呋喃丹死后降解雙重影響。

4 小 結(jié)

毒物的死后分布是指毒物濃度隨著取材部位的不同，檢材收集和時(shí)間間隔的不同而發(fā)生變化，毒物濃度與檢材種類和時(shí)間的依賴關(guān)系[9]。本研究利用HPLC-MS/MS法檢測了呋喃丹及其主要代謝物呋喃酚在大鼠不同器官組織中的含量，研究了二者在大鼠體內(nèi)死后分布的一般規(guī)律。經(jīng)研究證實(shí)，受染毒途徑、代謝途徑、毒物性質(zhì)等因素影響，呋喃丹及呋喃酚在灌胃染毒大鼠死后不同組織器官中的初始含量分布不同。提示對懷疑呋喃丹中毒的案例，除采集血液外，還應(yīng)盡可能收集肝、肺等檢材進(jìn)行毒物分析。不同器官組織中的毒物含量隨時(shí)間變化規(guī)律受呋喃丹自身降解及在不同組織間的擴(kuò)散遷移共同影響。死后分布對呋喃丹及呋喃酚的定量分析均會產(chǎn)生影響，但是呋喃丹降解產(chǎn)物呋喃酚的檢出可作為生前呋喃丹中毒的證據(jù)。同時(shí)，本研究建立的生物檢材中呋喃丹及代謝物呋喃酚的HPLC-MS/MS檢測方法對于呋喃丹原藥、代謝物呋喃酚和內(nèi)標(biāo)物西維因的檢出互不干擾，方法學(xué)考察均滿足實(shí)際檢測工作的需求，可用于呋喃丹中毒案件的法醫(yī)學(xué)鑒定。