何云富，張邵博，程 浩，蘭海鷗，李明生

(1.西北民族大學(xué) 生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 甘肅省動物細胞工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

由于固定化酶具有可重復(fù)利用，使用周期長等優(yōu)點，在研究應(yīng)用中被廣泛運用于食品，生物學(xué)，環(huán)境及工業(yè)生產(chǎn)中[1].基于胰蛋白酶特異性作用于蛋白質(zhì)的精氨酸，賴氨酸的羥基所形成的肽鍵，常用于水解蛋白質(zhì)[2].由于胰蛋白酶易發(fā)生自溶，使用一次后無法回收再利用，變性后無法去除而成為雜質(zhì)，常造成生產(chǎn)成本過高[3].為提高酶的利用率，制作成固定化酶，用于發(fā)酵罐水解蛋白等生產(chǎn)時，可降低生產(chǎn)成本[4].

在固定化酶技術(shù)中，載體材料上的活性基團、微環(huán)境，載體的形狀、大小、孔徑、表面積等因素，可影響載體與酶的親和力，固定化酶活力、穩(wěn)定性、重復(fù)使用性、可回收性及機械強度等[5].固定化酶需要滿足以下三個基本條件：①酶必須用簡單易行的方法固定于載體上；②酶載體必須很容易和反應(yīng)物產(chǎn)物分離；③載體必須能承受機械力[6].作為固定化酶的材料有介孔材料、納米材料、磁性材料及天然高分子材料.介孔材料具有有序、可調(diào)節(jié)的孔道結(jié)構(gòu)，相對于微孔材料具有較大的比表面積、較大的孔容、較窄的孔徑分布、良好的熱穩(wěn)定性及化學(xué)穩(wěn)定性等優(yōu)點.對其進行改性后，其表面可獲得配基，如-NH2、-SH、-CN、-Cl、-C6H5等有機官能團[7]，以提供大量與酶的結(jié)合位點，增加酶的穩(wěn)定性.納米材料如多孔納米金[8]、碳納米管等[9-10]具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、極高的機械強度、極大的韌性、良好的電導(dǎo)率、良好的生物相容性等優(yōu)點.磁性材料，一般為有機材料包覆，涂覆或含金屬離子的改性材料，如含四氧化三鐵的磁性納米材料[11].在納米材料的優(yōu)點基礎(chǔ)上 ，還可根據(jù)不同磁場、磁性，對固定化酶進行分離回收，使用更簡便[12].天然高分子材料具有來源廣泛，生物相容性較好的優(yōu)點.固定化酶主要分為物理固定和化學(xué)固定兩類，方法有吸附法、結(jié)合法、交聯(lián)法和包埋法，各方法均具有優(yōu)缺點[13].

曾嘉等以殼聚糖制成微球固定化葡萄糖氧化酶，獲得穩(wěn)定且活力回收率較高的固定化酶，但存在固定化酶固載量不高的缺點[14].由乳化固化法制備的纖維素微球為圓球形結(jié)構(gòu)，球徑為(100±10)um，經(jīng)與DEAE偶聯(lián)改性，獲得-NH2，偶聯(lián)上的大量氨基可與戊二醛發(fā)生Schiff反應(yīng)，再與酶固定化.片狀載體由高分子材料聚丙烯合成的用于動物細胞貼壁生長、半懸浮培養(yǎng)的載體，其內(nèi)部有網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，便于在交聯(lián)劑處理后與胰蛋白酶發(fā)生交聯(lián)[16].聚丙烯為親水性材料，可提高與胰蛋白酶的吸附特性，可提高與水解底物的充分接觸.徐堅等報道，強親水性材料聚丙烯對脂肪酶的吸附性相比于其他膜材料要高[15].本實驗選擇的材料為片狀載體和纖維素微球，以交聯(lián)法用于固定化胰蛋白酶，用戊二醛作為交聯(lián)劑[17].其優(yōu)點是適用范圍廣，固定化程度強，固定化后的胰蛋白酶不易脫落，可重復(fù)回收使用[18].探討影響固定化酶固載量和酶活比的主要因素：交聯(lián)劑類型、交聯(lián)劑濃度、固定化溫度、交聯(lián)時間、pH等，對兩種載體固定化胰蛋白酶的影響，并對其進行工藝優(yōu)化.

1 材料

1.1 材料及儀器

胰蛋白酶由明海生物有限公司提供，酶活比為25 U°/mg；酪蛋白為分析純蛋白煙臺市雙雙化工有限公司購買；纖維素微球為乳化固化法制得后經(jīng)150目篩，得到粒徑(50±10～100±10)um的微球(見圖1).片狀載體(見圖2)由明海生物有限公司提供，其他試劑均為分析純.

紫外可見分光光度計：型號Biomate 5上海奧析科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)，在A280處測量OD值；立式水平搖床：型號ZWY-1102C上海智成有限公司生產(chǎn)；磁力攪拌器：型號HJ-6B上海國華有限公司生產(chǎn)；便攜式酸度計：型號MP120-BLE梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司.

圖1經(jīng)偶聯(lián)DEAE纖維素微球(200 × )圖2片狀載體(200 × )

2 方法

2.1 固定化酶制備

固定化酶的制備過程主要包括：載體預(yù)處理、交聯(lián)、固定化以及固定化效果評價.評價指標為載體上的固定化含量以及活力回收率.

2.2 固定化酶制備單因素試驗

交聯(lián)法制備固定化酶工藝中影響固定化酶固載量和活力回收率的因素主要包括：交聯(lián)劑濃度、交聯(lián)時間、交聯(lián)溫度、固定化時間及酶的濃度.本文在前人的基礎(chǔ)上，重點考察以上因素對固定化酶制備的影響.

交聯(lián)劑濃度對酶固載量和酶活有較大影響，選擇戊二醛(glutaraldehyde，GA)作為交聯(lián)劑，是一種常用的同型雙功能交聯(lián)劑，兩個醛基可分別與HRP和抗體蛋白的氨基形成Schiff堿(-N=C-)，以五碳橋連接起來.戊二醛連接反應(yīng)是最溫和的交聯(lián)反應(yīng)之一.可在4～40 ℃范圍，pH 6.0～8.0的緩沖液中進行.另外，GA縮合體使被結(jié)合的蛋白分子與分子之間的間隔延長，免于蛋白分子的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[17].

2.2.1 交聯(lián)劑濃度

準確配制交聯(lián)劑濃度為1%、2%、3%、4%、 5%的戊二醛溶液，與片裝載體和纖維素微球分別進行交聯(lián)，恒定其他條件不變(交聯(lián)10 h，交聯(lián)溫度10 ℃，固定化時間10 h，pH=8.0，胰蛋白酶濃度2%)，測定酶固載量及活力回收率.

2.2.2 交聯(lián)溫度

在恒定其他試驗條件(戊二醛濃度2%，交聯(lián)10 h，pH =8.0，固定化時間10 h，胰蛋白酶濃度2%)的基礎(chǔ)上，分別選取交聯(lián)溫度10 ℃，20 ℃，30 ℃，測定載體上的胰蛋白酶固載量并記錄.

2.2.3 交聯(lián)時間

在恒定其他試驗條件(戊二醛濃度2%，交聯(lián)時pH =8.0，交聯(lián)溫度為10 ℃，固定化時間10 h，胰蛋白酶濃度2%)的基礎(chǔ)上，交聯(lián)時間分別選取5 h、10 h、15 h、20 h測定載體上的胰蛋白酶固載量并記錄.

2.2.4 胰蛋白酶濃度

在恒定其他試驗條件(戊二醛濃度2%，交聯(lián)溫度10 ℃，交聯(lián)時間10 h，交聯(lián)溫度10 ℃，固定化時間10 h，固定化pH為8.0)的基礎(chǔ)上，胰蛋白酶濃度設(shè)置為1%、1.5%、2%、2.5%、3%，分別測定載體上的胰蛋白酶固載量并記錄.

2.3 固定化酶制備的工藝優(yōu)化

2.3.1 正交試驗優(yōu)化

在前期的單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗，選取交聯(lián)溫度(A)，戊二醛濃度(B)，交聯(lián)時間(C)，固定化pH(D)四個因素，不考慮因素間的交互作用，每個因素設(shè)計三個平行，試驗方案見表1.

表1正交試驗方案L9(34)

試驗指標為固定化酶固載量和固定化酶的活力回收率.考慮到生產(chǎn)成本和經(jīng)驗條件，固定化酶的活力回收率比固定化酶固載量重要性大，活力回收率權(quán)數(shù)取3，酶固載量權(quán)數(shù)為1，綜合平衡法得出較優(yōu)方案.

經(jīng)正交實驗獲得較優(yōu)的兩種載體的固定化胰蛋白酶制備工藝，以較佳工藝路線作為實驗條件，進行驗證實驗.

2.4 載體預(yù)處理

纖維素微球偶聯(lián)氨基(使用DEAE)，經(jīng)偶聯(lián)的纖維素微球和片狀載體在相同條件下進行處理.用純水水洗后，以70%乙醇經(jīng)30 min浸泡，棄乙醇；4%NaOH經(jīng)磁力攪拌器常溫攪拌30 min，去離子水水洗3遍；0.5 mol/L的硫酸銨溶液經(jīng)磁力攪拌器常溫攪拌30 min，去離子水水洗3遍；4%HCl經(jīng)磁力攪拌器常溫攪拌30 min，去離子水水洗3遍；4%NaOH經(jīng)磁力攪拌器常溫攪拌30 min，去離子水水洗，用酸度計測pH，水洗至載體pH與去離子水相同.

2.5 胰蛋白酶濃度與吸光度關(guān)系標準曲線及其方程

準確配制0.5%、1%、1.5%、2%胰蛋白酶溶液，在280 nm處測OD值制作標準曲線(2≤OD≤0.8)，得出胰蛋白酶濃度與OD值之間的方程，y=ax+b(x為測定處的OD值，y為溶液中的胰蛋白酶濃度)，R2≥0.95，則標準曲線方程可信.

標準曲線方程：y=7.5253x-0.053，R2=0.9832 >0.95.

試驗溶液中胰蛋白酶含量由該方程計算得出.

2.6 固定化酶效果檢測

2.6.1 貯藏穩(wěn)定性

貯藏穩(wěn)定性：稱取5 g纖維素微球固定化胰蛋白酶經(jīng)水洗，抽濾，加入至20 mL純水中，放入磁轉(zhuǎn)子，置于300 r/min，溫度設(shè)定為50 ℃的磁力攪拌器上，每隔7 d測OD值(吸光值280 nm處)，空白對照為純水.經(jīng)5次測量OD值，計算固定化酶固載量，測定酶活比.

2.6.2 操作穩(wěn)定性

將兩種固定化酶分別稱取5份，每份2 g，在100 mL的2%酪蛋白溶液，45 ℃下連續(xù)反應(yīng) 10次.每次反應(yīng)時間為2 h.每次反應(yīng)后分別測定酶活力，檢測兩種材料的載體固定化酶的操作穩(wěn)定性.

2.6.3 酶固載量

以固定化不同時間點的載體上的胰蛋白酶濃度做為評價指標，以紫外分光光度計測量OD值，吸光值設(shè)置為280 nm.以胰蛋白酶標準曲線計算載體上固定的胰蛋白酶含量，以確定固定化率.

Z=(K-S)/5g，G%=Z/K.

Z：每克載體上含有的胰蛋白酶毫克數(shù);K：固定化前加入的溶液中胰蛋白酶的含量;S：固定化結(jié)束時反應(yīng)容器中胰蛋白酶量;G：固定在載體上的胰蛋白酶占加入的胰蛋白酶量的比例.

2.6.4 酶活力回收率

游離酶參照國標測定.蛋白酶在一定的溫度與pH條件下水解底物，產(chǎn)生含有酚基的氨基酸(如：酪氨酸、色氨酸等)，在堿性條件下，將福林試劑(Folin)還原，生成鉬藍與鎢藍，用分光度法測定，計算其酶活力.固定化酶活力回收率參考庫漢生等固定化胰蛋白酶活力的測定方法探討[19]，使用固定化胰蛋白酶活力濕態(tài)直接測量法.酶活力回收率為固定化酶第5次水解酪蛋白時的酶活比比以第一次水解時的酶活比.

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗結(jié)果

3.1.1 交聯(lián)劑濃度

圖3交聯(lián)劑濃度與酶固載量圖4交聯(lián)劑濃度與酶活力回收率

由圖3和圖4試驗結(jié)果可知，隨戊二醛濃度升高，固定胰蛋白酶含量上升.但如果戊二醛濃度高就會影響胰蛋白酶活力回收率.在3%時固定化率較高，但胰蛋白酶活力回收率相應(yīng)降低.隨戊二醛濃度的升高，胰蛋白酶二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致胰蛋白酶失活.

3.1.2 交聯(lián)溫度

按試驗方法進行交聯(lián)溫度選擇，在10 ℃時胰蛋白酶在載體上的酶固載量為46 mg/g，但由于戊二醛分子間的交聯(lián)，使得胰蛋白酶含量較低，20 ℃時提高了固定化酶上的胰蛋白酶含量，達到51 mg/g.當溫度升高，胰蛋白酶固載量不再增加.

3.1.3 交聯(lián)時間

由圖5可以看出，隨交聯(lián)時間的增加，載體上的固定化胰蛋白酶含量增加，最適的交聯(lián)時間為10小時，之后酶固載量增加無明顯升高.原因可能與酶和載體的固定化位點達到飽和有關(guān).

如圖6所示，在胰蛋白酶含量為3%時，兩種材料上的胰蛋白酶固載量接近最大值，選取3%作為最大固定化胰蛋白酶濃度.

圖5 交聯(lián)時間對固定化酶固載量的影響 圖6 不同濃度胰蛋白酶在兩種載體上的固定化效果比較

3.1.4 胰蛋白酶濃度的選擇

3.2 正交試驗

經(jīng)單因素試驗確定兩種材料固定化胰蛋白酶的因素水平，進行四因素三水平正交試驗設(shè)計，為L9(34)(見表1)，試驗結(jié)果見表2及表4.

表2纖維素微球固定化胰蛋白酶正交試驗結(jié)果

為比較四個因素對固定化胰蛋白酶制備工藝影響的大小，試驗結(jié)果進行極差分析，結(jié)果表明：胰蛋白酶濃度>交聯(lián)劑濃度>交聯(lián)時間>交聯(lián)溫度.片狀載體和DEAE偶聯(lián)的纖維素微球的最優(yōu)制備工藝為：3%的胰蛋白酶，交聯(lián)時間10 h，交聯(lián)溫度10 ℃，2%戊二醛.在此條件下，交聯(lián)制備的纖維素微球固定化胰蛋白酶，其固定化酶固載量和胰蛋白酶活力回收率達到較優(yōu).

在纖維素微球固定化胰蛋白酶的試驗中，經(jīng)(表3)方差分析結(jié)果確定、交聯(lián)時間、交聯(lián)溫度、交聯(lián)劑濃度、胰蛋白酶濃度對酶固載量有影響.胰蛋白酶濃度對纖維素微球固定化胰蛋白酶的酶活力回收率無影響，其余3種因素對酶活力回收率均有影響.在片狀載體固定化胰蛋白酶實驗中，經(jīng)(表5)方差分析結(jié)果確定，交聯(lián)時間、交聯(lián)溫度、交聯(lián)劑濃度、胰蛋白酶濃度對酶固載量有影響，胰蛋白酶濃度對片狀載體固定化胰蛋白酶的酶活力回收率無影響，其余3種因素對酶活力回收率均有影響.

表3纖維素微球固定化胰蛋白酶方差分析表

表4 纖維素微球固定化胰蛋白酶正交試驗結(jié)果

表5 纖維素微球固定化胰蛋白酶正交試驗方差分析表

以較佳組合作為試驗條件，以兩種材料固定化胰蛋白酶，進行各組獨立性重復(fù)實驗(n=6).結(jié)果進行t檢驗，載體為DEAE偶聯(lián)纖維素微球的固定化酶，其胰蛋白酶固載量為145 mg/g ， 酶的活力回收率為17.3%.以片狀載體固定化胰蛋白酶試驗，其酶固載量為112.6 mg/g，酶的活力回收率為14%.結(jié)果進行t檢驗，結(jié)果表明，DEAE偶聯(lián)纖維素微球的固定化酶的酶固載量顯著高于片狀載體固定化胰蛋白酶(P<0.05，n=6)，活率回收率無顯著性差異.纖維素微球作為載體酶固載量高的原因為：纖維素微球偶聯(lián)DEAE獲得氨基，與戊二醛發(fā)生Schiff反應(yīng)產(chǎn)生更多的固定化位點有關(guān)，且氨基為親水基團，可提高對胰蛋白酶的吸附能力.

3.3 穩(wěn)定性

3.3.1 貯藏穩(wěn)定性

較佳工藝路線制備的兩種固定化胰蛋白酶，于4 ℃冷藏保存，每間隔7 d，測定OD值，計算酶固載量，并測定酶活比.結(jié)果表明，纖維素微球固定化胰蛋白酶在35 d后，酶固載量無明顯下降，仍保持在98%以上，片狀載體酶固載量保持在96%以上.纖維素微球固定化胰蛋白酶活力回收率降低且小于4%；片狀載體酶活力回收率降低且小于6%.兩種材料相比，纖維素微球作為載體固定化胰蛋白酶的儲存穩(wěn)定性較好.

3.3.2 操作穩(wěn)定性

圖7 兩種載體固定化胰蛋白酶的操作穩(wěn)定性

兩種載體的固定化胰蛋白酶，連續(xù)10次反應(yīng)后，測定的胰蛋白酶活結(jié)果如圖7所示.纖維素微球固定化胰蛋白酶酶活基本保持穩(wěn)定，活力損失小于14%，片狀載體固定化胰蛋白酶的酶活降低比纖維素明顯，活力損失小于22%.由此可見，兩種材料的固定化胰蛋白酶都具有良好的操作穩(wěn)定性，且經(jīng)偶聯(lián)DEAE的纖維素微球效果更佳.

4 討論

本試驗以不同載體作為固定化胰蛋白酶的材料，對兩種材料固定化效果進行評價，結(jié)果表明：纖維素微球作為載體的固定化酶比片狀載體效果更佳.兩種材料的固定化酶種，經(jīng)偶聯(lián)DEAE的纖維素微球作為載體固定化胰蛋白酶，表現(xiàn)出酶固載量、酶活、貯存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性都比親水聚丙烯片狀載體效果要好.本研究表明，選擇親水性生物材料更有利于固定化酶的性能，對親水性材料進行改性，使得固定化材料獲得更多與酶發(fā)生交聯(lián)或偶聯(lián)的位點，提高酶固載量和操作穩(wěn)定性.基于本試驗，我們發(fā)現(xiàn)，纖維素微球回收仍然有較大的困難，后期考慮加入磁粉(Fe3O4)，制作帶有磁性的纖維素微球作為固定化載體，可固定化某些價格高昂，難以提取的酶，以便于有效回收和重復(fù)利用.

本研究旨在對固定化胰蛋白酶材料進行探究，找到既能大量固定胰蛋白酶，又能保證酶活，既能簡便回收以重復(fù)利用，又能很大程度上降低生產(chǎn)成本的生物材料，為今后的固定化酶材料研究提供理論依據(jù).