張海霞， 趙克學(xué)， 鄧盈盈， 梁浩勤， 李 倩， 韓玉梅， 馬忠仁， 馮若飛

(1.西北民族大學(xué) 生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

跨膜蛋白43(Transmembrane protein 43)又稱LUMA或TMEM43，在人體中主要由TMEM43基因編碼[1].該蛋白包含4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)大的親水性結(jié)構(gòu)域[2].該親水性結(jié)構(gòu)域位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腔內(nèi)，并暴露于核周空間，而兩端均位于細(xì)胞質(zhì)或核質(zhì)中，TMEM43的一小部分被保留在核膜層，是內(nèi)核膜的完整膜蛋白[3]，可在內(nèi)核膜上形成蛋白復(fù)合體來維持核包膜結(jié)構(gòu).

目前為止，對(duì)于TMEM43基因在心肌組織中的表達(dá)定位尚存在爭(zhēng)議.相關(guān)研究表明TMEM43在心肌閏盤[4]、組織的肌纖維膜[5]、血液和心臟[6-7]，甚至心肌和骨骼肌在內(nèi)的組織內(nèi)等均有表達(dá)，且以單聚體、二聚體、三聚體、四聚體及寡聚體等不同形式存在[9-10].而Muchir等則認(rèn)為該基因編碼lamin蛋白，而該蛋白在核內(nèi)參與DNA復(fù)制、染色質(zhì)重塑以及核孔定位等過程[11-12]，因此該基因的突變可能會(huì)改變基因水平上的調(diào)控過程[13-14].

研究表明，與TMEM43相關(guān)的疾病主要有致心律失常性右室心肌病(arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy， ARVC)和埃德型肌營養(yǎng)不良癥(Emery-Dreifuss muscular dystrophy， EDMD)[2，15，16]，研究僅發(fā)現(xiàn)TMEM43基因相關(guān)位點(diǎn)的突變可引起ARVC[17-21]或EDMD[22].

但目前為止，針對(duì)TMEM43基因及其在組織內(nèi)表達(dá)情況尚未進(jìn)行深入研究，結(jié)構(gòu)及功能認(rèn)識(shí)十分有限，對(duì)其在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮的作用、不同組織內(nèi)的表達(dá)含量及其作用等問題沒有詳實(shí)資料可解釋.由此，對(duì)其突變引起的ARVC和EDMD研究僅限于疾病本身，且對(duì)TMEM43的表達(dá)情況定量檢測(cè)尚屬空白，Bengtsson和Otto在研究中也僅通過常規(guī)RT-PCR方法對(duì)不同組織內(nèi)TMEM43 mRNA水平的含量進(jìn)行了常規(guī)檢測(cè)，并未定量[2].基于此，后期如果要對(duì)該基因進(jìn)一步研究，就需要一種精準(zhǔn)定量的檢測(cè)方法作為研究基礎(chǔ).

本研究擬選擇SYBR Green I染料建立一種簡便、經(jīng)濟(jì)、且能精確定量TMEM43基因表達(dá)的檢測(cè)方法[23-25]，以MRC-5細(xì)胞為材料，建立TMEM43 SYBR Green I real-time PCR方法，利用建立的方法檢測(cè)不同組織內(nèi)TMEM43 基因表達(dá)情況.根據(jù)TMEM43基因表達(dá)水平的不同，分析其主要分布位置.該研究為TMEM43 基因表達(dá)提供了檢測(cè)手段，也為進(jìn)一步研究TMEM43的結(jié)構(gòu)及功能奠定基礎(chǔ)，提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)、幼年敘利亞倉鼠腎細(xì)胞(BHK-21)、非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)、牛腎細(xì)胞(MDBK)、犬腎細(xì)胞(MDCK)、豬腎細(xì)胞(PK15)、人星形神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(u251)、人原發(fā)性肝癌細(xì)胞(PLC/PRF/5)、人胚腎細(xì)胞(HEK293)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HuvEc)由甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心提供.

1.1.2 主要試劑及儀器

胎牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑、Taq DNA聚合酶、總RNA提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司；SYBR Select Master Mix試劑盒購自美國ABI公司；Easy Pure Quick Gel Extraction Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；EasyPure Plasmid MiniPrep Kit購自上海生工生物有限公司；PCR儀購自德國Biometra公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào):7500)購自美國ABI公司；核酸蛋白快速檢測(cè)儀(型號(hào): BioPhotometer Plus)購自德國Eppendorf公司；凝膠成像系統(tǒng)購自美國GE公司.

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

參照Genbank公布的TMEM43基因序列(登錄號(hào)NM_024334.2)，通過引物軟件Primer Primer5.0和Oligo 6.0設(shè)計(jì)1對(duì)預(yù)期擴(kuò)增目的片段為88 bp的特異性擴(kuò)增引物(TMEM43-qF/R)，同時(shí)設(shè)計(jì)一條擴(kuò)增TMEM43 CDS區(qū)全長目標(biāo)序列為1 200 bp的TMEM43通用引物TMEM43-hF/R，并由大連寶生物合成(表1).

表1引物的核苷酸序列

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的制備

抽提MRC-5細(xì)胞總RNA(共60 μL)，取10 μL mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后作為模板，利用引物TMEM43-hF/R PCR擴(kuò)增目的基因片段.25 μL反應(yīng)體系：dNTPs(10 mmol/L) 0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，上、下游引物TMEM43-hF/R (20 pmol/μL)各0.5 μL，cDNA模板 2.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL) 0.5 μL， DEPC H2O 18.5 μL.反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min.利用10.0 g/L的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物.

純化PCR產(chǎn)物并連接至pMD18-T載體，篩選的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定.陽性質(zhì)粒tongg核酸蛋白快速檢測(cè)儀分別測(cè)定260 nm及280 nm處的OD值(吸光值)，計(jì)算液體中質(zhì)粒的copies/μL.將該陽性質(zhì)粒命名為TMEM43-Stand.

1.2.3 TMEM43 SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

選用SYBR Green I染料法，加入SYBR Green I PCR引物，在ABI real-time PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，并根據(jù)計(jì)算機(jī)生成結(jié)果進(jìn)行分析.25 μL總體系，遵循Ct值最小和熒光閾值最高原則，并確保溶解曲線無非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，在此基礎(chǔ)上分別優(yōu)化最佳引物使用濃度及退火溫度等條件.

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

測(cè)定TMEM43-Stand質(zhì)粒的OD260nm值，計(jì)算質(zhì)粒濃度，以DEPC H2O 10倍倍比稀釋成6個(gè)梯度(1.71×108～1.71×103copies/μL).作為模板，25 μL反應(yīng)體系，利用優(yōu)選條件，在ABI real-time PCR儀上進(jìn)行反應(yīng).反應(yīng)完畢，根據(jù)ABI real-time PCR儀軟件自動(dòng)計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.2.5 靈敏性驗(yàn)證

將TMEM43-Stand質(zhì)粒10倍倍比稀釋，每個(gè)梯度各自為模板進(jìn)行SYBR Green I real-time PCR反應(yīng)(1.71×1010～1.71×10 copies/μL 10個(gè)梯度)以及普通PCR反應(yīng)(1.71×1010～1.71×10 copies/μL 10個(gè)梯度)，以確定兩種方法的檢測(cè)下限.

1.2.6 重復(fù)性驗(yàn)證

選取1.71×1010～1.71×106copies/μL的重組質(zhì)粒為樣本，分別進(jìn)行SYBR Green I real-time PCR反應(yīng)，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，評(píng)價(jià)該方法的可重復(fù)性.

1.2.7 SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用

選取5種不同組織的人源細(xì)胞及6種哺乳動(dòng)物來源細(xì)胞，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)各取6×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄.利用上述TMEM43 SYBR Green I real-time PCR方法對(duì)各細(xì)胞內(nèi)TMEM43基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè).

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

從MRC-5細(xì)胞抽提的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，用TMEM43 -hF/R引物進(jìn)行PCR反應(yīng).電泳結(jié)果顯示，目的基因大小符合預(yù)期(1 200 bp).PCR產(chǎn)物連接載體構(gòu)建的克隆載體經(jīng)PCR、雙酶切及序列測(cè)定等驗(yàn)證，顯示成功構(gòu)建了質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(圖1).該質(zhì)粒命名為TMEM43-Stand.根據(jù)拷貝數(shù)計(jì)算公式：[6.02×1023×(ng/μL×10-9)]/(DNA length×660)=copies/μL，得出該質(zhì)?？截悢?shù)為1.71×1011copies/μL.

圖1 PCR產(chǎn)物及重組質(zhì)粒的鑒定

2.2 TMEM43 SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

優(yōu)選的TMEM43 SYBR Green I real-time PCR 25 μL體系為：SYBR Select Master Mix (2×) 12.5 μL， DEPC H2O 9.7 μL，上、下游引物TMEM43-q F/R(10 pmol/μL)各0.4 μL，cDNA模板 2.0 μL.最佳反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，61.5 ℃ 35 s，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s；65 ℃至95 ℃，每0.5 ℃/s，10 s/cycle為間隔繪制溶解曲線.該條件下繪制的溶解曲線峰單一，表明擴(kuò)增產(chǎn)物較好，無非特異性產(chǎn)物和引物二聚體(見圖2).

圖2 TMEM43 SYBR Green I熒光定量PCR擴(kuò)增曲線(A)及溶解曲線(B)

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將TMEM43-Stand標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋后，各濃度分別為模板進(jìn)行SYBR Green I real-time PCR，得到動(dòng)力學(xué)曲線(圖3A)、溶解曲線(圖3B)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3C).初始模板濃度與Ct值線性關(guān)系較好，y=-3.502logx+42.853，擴(kuò)增效率93.012%，相關(guān)系數(shù)R2=1.

圖3 TMEM43 SYBR Green I熒光定量PCR動(dòng)力學(xué)曲線(A)、溶解曲線 (B)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(C)

2.4 靈敏性驗(yàn)證

以系列稀釋的TMEM43-Stand標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行SYBR Green I real-time PCR及普通PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示SYBR Green I real-time PCR檢測(cè)下限為17.1 copies/μL(圖4A)，而普通PCR檢測(cè)下限為1.71×102copies/μL(圖4B).表明，建立的SYBR Green I real-time PCR比普通PCR靈敏10倍.

圖4 TMEM43 SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(A)與普通PCR(B)的靈敏性

2.5 重復(fù)性驗(yàn)證

經(jīng)選取1.71×1010～1.71×106copies/μL的重組質(zhì)粒為樣本，重復(fù)3次進(jìn)行SYBR Green I real-time PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示，重復(fù)樣本3條S型曲線之間的誤差均小于1個(gè)循環(huán)(圖5).表明建立的TMEM43 SYBR Green I real-time PCR方法具有較高的可重復(fù)性，從而可證明建立的方法可確保不同樣品間結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性.

圖5 TMEM43 SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性

2.6 SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用

通過對(duì)選取的MDCK、MDBK、PK15、BHK21、Vero及MRC-5等不同物種來源的哺乳動(dòng)物細(xì)胞及u251、HuvEc、PLC/PRF/5、HEK293及MRC-5等人源細(xì)胞進(jìn)行SYBR Green I real-time PCR方法對(duì)TMEM43基因表達(dá)情況的檢測(cè).結(jié)果顯示，在該方法的檢測(cè)范圍內(nèi)(檢測(cè)下限為17.1個(gè)拷貝/μL).不同人源組織細(xì)胞中，僅MRC-5及HEK293細(xì)胞可檢出TMEM43基因表達(dá)；而不同哺乳動(dòng)物細(xì)胞中僅Vero細(xì)胞可檢出(表2).

表2不同細(xì)胞中TMEM43表達(dá)量

3 討論

通過該實(shí)驗(yàn)研究，成功建立了檢測(cè)跨膜蛋白43(TMEM43)基因表達(dá)量的SYBR Green I real-time PCR方法，優(yōu)選反應(yīng)條件優(yōu)化后進(jìn)行方法的評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，引物溶解曲線均為單峰，特異性好.該方法靈敏性較普通PCR高10倍且重復(fù)性較好.檢測(cè)不同哺乳動(dòng)物細(xì)胞中TMEM43表達(dá)量，顯示TMEM43表達(dá)量在不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞也有所不同，其中Vero表達(dá)量最高，MRC-5細(xì)胞及HEK293細(xì)胞次之，其余細(xì)胞未檢出.該結(jié)果與Merner等研究結(jié)果相符合，表明TMEM43在不同物種不同組織中表達(dá)[7].

針對(duì)TMEM43的研究，目前涉及的較多的是其與致心律失常性右室心肌病(ARVD)相關(guān)的研究[15]，確定TMEM43基因?yàn)锳RVD5的致病基因[7，16].但是目前，對(duì)于TMEM43的結(jié)構(gòu)及功能知之甚少，進(jìn)而對(duì)該基因的進(jìn)一步研究受到限制；且對(duì)不同組織內(nèi)TMEM43表達(dá)情況的檢測(cè)研究更少.本實(shí)驗(yàn)首次成功建立了TMEM43 SYBR Green I real-time PCR檢測(cè)方法.該方法選用簡便、成本較低的染料法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[25].本研究針對(duì)TMEM43 mRNA進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法的建立.嚴(yán)格意義上來講，應(yīng)選用合成的RNA標(biāo)準(zhǔn)品來進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及檢測(cè).RNA標(biāo)準(zhǔn)品可信度較DNA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品高，但是因反轉(zhuǎn)錄效率不可能達(dá)到100%，實(shí)際操作過程越多誤差就越大.考慮到臨床樣本檢測(cè)的實(shí)際可操作性及經(jīng)濟(jì)因素，本研究最終選擇制備的DNA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行方法建立及檢測(cè).最終結(jié)果顯示，該方法中未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物及引物二聚體，說明引物設(shè)計(jì)及條件優(yōu)化良好.該方法能成功檢出不同哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的TMEM43表達(dá)量，為今后臨床樣本中TMEM43基因表達(dá)情況的檢測(cè)提供實(shí)驗(yàn)技術(shù)，也為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).