肖 敏,趙冰冰,常宏建,任曉麗,劉 云

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150030)

在獸醫(yī)臨床上,腫瘤為犬常發(fā)疾病之一。據(jù)報(bào)道[1],發(fā)病率排名前五位的腫瘤依次為乳腺腫瘤、皮膚腫瘤、肛周瘤、睪丸腫瘤、陰道腫瘤。犬作為與人類關(guān)系最密切的伴侶動(dòng)物,無論從臨床癥狀,細(xì)胞和組織病理學(xué)分類以及診斷上,犬腫瘤都與人類腫瘤具有較高的相似性,犬可以作為人類腫瘤研究的完美模型[2-3]。反之,人類腫瘤的研究成果也可適當(dāng)借鑒到犬腫瘤的研究領(lǐng)域,為犬腫瘤的治療提供新的方向和靶點(diǎn)[4]。

血管生成是指在現(xiàn)有的脈管系統(tǒng)中形成新的血管,是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)重要特征[5-6]。在促進(jìn)腫瘤血管生成的多種細(xì)胞因子中,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是最主要因子,具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增生和趨化的作用[7-8],并能增強(qiáng)血管通透性及促進(jìn)腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[9],在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中是必不可少的[10]。VEGF,通常被稱為血管內(nèi)皮生長因子,在大多數(shù)腫瘤中均有表達(dá),其表達(dá)與腫瘤進(jìn)展有關(guān)[11]。因此,VEGF的過度表達(dá)可作為腫瘤疾病診斷標(biāo)志物之一[12]。

1 材料與方法

1.1 材料 6～8周齡 BALB/c雌性小鼠,體重18～25 g,購自黑龍江省品臣科技有限公司;BL21,購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;EcoRI,SalI,購自寶生物工程(大連)有限公司;胎牛血清,購自浙江天杭生物科技股份有限公司;RPM1640培養(yǎng)基,購自GIBCO公司;卡那霉素、HAT干粉(50)、HT干粉(50)、弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、聚乙二醇(PEG4000)、單克隆抗體亞型鑒定試劑盒,均購自Sigma公司;兔抗犬VEGF單克隆抗體,購自上海優(yōu)維寧生物科技股份有限公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗鼠/兔IgG,購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 犬VEGF引物的設(shè)計(jì)與蛋白的表達(dá) 進(jìn)入GenBank數(shù)據(jù)庫,查找犬VEGF基因序列。設(shè)計(jì)引物,基因擴(kuò)增后,構(gòu)建原核表達(dá)載體,誘導(dǎo)犬VEGF蛋白。

1.2.2 小鼠免疫 以重組表達(dá)的VEGF蛋白為抗原免疫小鼠,共3次。最后1次免疫3 d后,采血,檢測血清效價(jià),取效價(jià)最高的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合。

1.2.3 雜交瘤細(xì)胞株建立 要融合時(shí),提前3 d對(duì)效價(jià)高的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫,取小鼠的脾細(xì)胞,與骨髓瘤細(xì)胞融合。利用ELISA法,篩選陽性克隆。

1.2.4 單克隆抗體的大量制備 取10周齡左右小鼠腹腔注射液體石蠟。7 d后用PBS重懸陽性單克隆雜交瘤細(xì)胞株,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),注入小鼠腹腔內(nèi)。7～10 d后收集腹水,離心,取上清分裝,-80℃保存。采用飽和硫酸銨沉淀法純化腹水。

1.2.5 單克隆抗體的特異性檢測 采用免疫印跡技術(shù)(Western Blot)和免疫熒光共聚焦技術(shù)檢測單克隆抗體特異性。

1.2.6 ELISA檢測方法的建立 (1)單抗最佳包被濃度和多抗最佳稀釋度的確定。使用十字交叉法,對(duì)單抗和多抗進(jìn)行稀釋。按照標(biāo)準(zhǔn)雙抗夾心ELISA法進(jìn)行檢測,每個(gè)稀釋度作3個(gè)平行復(fù)孔,確定最佳濃度;(2)ELISA試劑盒陰陽性臨界值的確定。

用本研究制備的診斷試劑盒檢測64份陰性血清樣品,計(jì)算出血清樣品的平均OD450nm值和標(biāo)準(zhǔn)差SD,且每份陰性樣品OD值是通過3次雙抗夾心ELISA求的平均值。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,臨界值=樣品的平均OD值+3SD,當(dāng)臨界值＞樣品的平均OD值+3SD為陽性,臨界值≦樣品的平均OD值+2SD時(shí)為陰性,當(dāng)樣品的平均OD值+2SD＜臨界值≦樣品的平均OD值+3SD為可疑,需重新檢測樣品。

1.2.7 對(duì)臨床收集的犬血清樣本中的VEGF水平進(jìn)行ELISA檢測分析 使用已建立的雙抗夾心ELISA方法學(xué)體系,對(duì)臨床收集的96例犬血清樣本作ELISA檢測,其中包括16份犬乳腺腫瘤,25份結(jié)石,9份子宮蓄膿,20份正常犬,26份皮膚腫塊。

2 結(jié)果

2.1 免疫后小鼠血清效價(jià)檢測結(jié)果 從圖1中可以看出,第3次免疫后小鼠血清效價(jià)在1∶64 000～1∶128 000,證明小鼠免疫成功,可以進(jìn)行下一步細(xì)胞融合試驗(yàn)。將此血清按1∶4 000稀釋后用作篩選試驗(yàn)的陽性對(duì)照。

圖1 VEGF免疫小鼠血清效價(jià)檢測

2.2 單克隆雜交瘤細(xì)胞株的建立 融合成功后,通過間接ELISA法篩選陽性孔,陽性孔的雜交瘤細(xì)胞再經(jīng)過3次亞克隆,確保每個(gè)孔中細(xì)胞均是由1個(gè)細(xì)胞分裂而來。最終所有克隆孔的陽性克隆率達(dá)100%時(shí),將該細(xì)胞株建系,如此方法得到1株雜交瘤細(xì)胞,命名為3B4。對(duì)該雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行凍存,以用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 抗體亞類鑒定及腹水產(chǎn)生 通過小鼠單克隆抗體亞類鑒定試劑盒進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,雜交瘤細(xì)胞株3B4所分泌的抗體類型為Ig2a型。腹水純化后,采用間接ELISA法對(duì)其進(jìn)行效價(jià)測定。結(jié)果效價(jià)為1∶6 400,證明雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔中成功分泌抗體,且純化成功。

2.4 單克隆抗體的特異性檢測

2.4.1 Western Blot檢測結(jié)果 由圖2可以看出3類腫瘤細(xì)胞在蛋白為27 kD大小位置均出現(xiàn)相應(yīng)條帶,與預(yù)期VEGF蛋白大小一致。因此初步判定純化后的腹水抗體能識(shí)別并結(jié)合此3種腫瘤細(xì)胞中的VEGF蛋白。確定了所制備單克隆抗體的特異性。

圖2 Western Blot檢測3B4所分泌抗體特異性

2.4.2 免疫熒光檢測結(jié)果 如封二彩版圖3所示,左圖為FITC檢測通道的細(xì)胞漿熒光信號(hào),中圖為FITC檢測通道的細(xì)胞核熒光信號(hào),右圖為上述兩圖的合成。由封二彩版圖3可知,3B4所分泌的抗體能在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中檢測到VEGF蛋白的表達(dá),并且對(duì)于VEGF在細(xì)胞中所處的位置能起到指示作用。

2.5 ELISA檢測方法的建立

2.5.1 單抗最佳包被濃度和多抗最佳稀釋度的確定由表1我們可以得知當(dāng)多抗以1∶1 400包被,單抗以1∶8 000稀釋為ELISA雙抗夾心的最佳工作濃度。

表1 單抗最佳包被濃度和多抗最佳稀釋濃度

2.5.2 ELISA試劑盒陰陽性臨界值的確定 由表2結(jié)果我們計(jì)算出：平均值為0.298,標(biāo)準(zhǔn)差為0.149,臨界值為0.745,大于0.745為陽性,小于等于0.596為陰性,大于0.596且小于等于0.745為可疑,需重新檢測樣品,其中出現(xiàn)了一個(gè)可疑和2個(gè)假陽性樣品,進(jìn)一步驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)為陰性。

2.6 對(duì)臨床收集的犬血清樣本進(jìn)行ELISA檢測分析 用本研究制備的試劑盒對(duì)臨床收集的96份樣本進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示,陽性樣本14份,陰性樣本82份,而實(shí)際陽性樣本為16份。其陽性符合率為87.5%,陰性符合率為97.56%。說明本研究制備的試劑盒具有較高的符合率。

表2 ELISA試劑盒陰陽性臨界值的確定

表3 犬血清ELISA檢測分析

3 討論

血管內(nèi)皮生長因子作為血管生成開關(guān)的關(guān)鍵介質(zhì),通過參與多種血管生成過程,在腫瘤血管生成中起著核心作用,包括內(nèi)皮細(xì)胞的存活、增殖、遷移和高通透性[13]。VEGF對(duì)腫瘤還有其他作用,包括抑制腫瘤細(xì)胞凋亡,刺激腫瘤轉(zhuǎn)移,抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)和增加腫瘤血管的通透性,減少化療藥物對(duì)腫瘤的影響等[14]。

相關(guān)研究證實(shí),血清VEGF在人類乳腺癌患者中呈現(xiàn)高表達(dá),并且與乳腺癌的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān),血清VEGF可為乳腺癌的早期診斷、靶向治療和預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)[15]。了解在發(fā)展過程中血管內(nèi)皮生長因子的調(diào)節(jié)作用也可以觀察腫瘤的血管化,因?yàn)槟[瘤在發(fā)展過程中利用器官或組織特異性的VEGF監(jiān)管機(jī)制是非常有可能的。腫瘤血管化、生長和轉(zhuǎn)移之間的明顯聯(lián)系導(dǎo)致了抗血管生成藥物的發(fā)展。VEGF作為血管生成調(diào)節(jié)因子的核心,使它成為治療的主要目標(biāo)。且已經(jīng)制備出抗人VEGF的單克隆抗體,此單抗在人醫(yī)臨床發(fā)揮著重要的作用。

一些研究表明,犬腫瘤分泌的VEGF能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活[16-17]。犬乳腺腫瘤中,VEGF在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)都有增加。VEGF高表達(dá)與不良的臨床結(jié)果有關(guān),包括降低生存率,還與化療或放療缺乏反應(yīng)之間也有關(guān)聯(lián)。因此臨床上乳腺腫瘤患犬VEGF水平的檢測,會(huì)對(duì)患犬的預(yù)后及治療有指導(dǎo)性意義。但是犬VEGF的臨床檢測需要針對(duì)犬屬VEGF的特異性抗體,目前在市面上銷售的這種抗體價(jià)格比較昂貴且只適用于實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn),因此大量制備抗犬VEGF的單克隆抗體有應(yīng)用價(jià)值,可為雙抗夾心試劑盒的制備提供材料。在本研究中,將VEGF作為診斷標(biāo)志物利用夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測其在腫瘤患犬中的表達(dá),可為獸醫(yī)臨床犬腫瘤的早期診斷提供良好的診斷方法。

4 結(jié)論

綜上所述,本研究成功制備了一種新的具有良好生物活性的鼠抗犬VEGF單克隆抗體3B4,該抗體能夠特異性識(shí)別VEGF蛋白,并成功的制備了以該抗體為捕獲抗體的雙抗夾心ELISA檢測試劑盒,此試劑盒具有良好的敏感性、特異性和重復(fù)性,且利用本試劑盒對(duì)臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證時(shí),陽性符合率為87.5%,陰性符合率為97.56%,具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值,有望應(yīng)用于臨床犬早期乳腺腫瘤的診斷和篩查以及治療預(yù)后評(píng)價(jià)。