董愛(ài)華 韓 克

1．南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院( 210093) ;2．南京鼓樓醫(yī)院

子宮內(nèi)膜癌是常發(fā)生于子宮內(nèi)膜中的一種上皮性惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率與死亡率，確診時(shí)多為中晚期，早期確診并有效治療可延長(zhǎng)患者生存時(shí)間［1］。目前臨床常通過(guò)檢測(cè)血清標(biāo)志物而診斷早期子宮內(nèi)膜癌，但缺乏特異性及敏感性導(dǎo)致預(yù)后效果差，因而需尋找新的子宮內(nèi)膜癌生物學(xué)標(biāo)志物以提高臨床診療效果并有效評(píng)估預(yù)后［2］。miRNAs 是一類非編碼單鏈核苷酸RNA 分子，可通過(guò)與mRNA 3’UTR 區(qū)序列結(jié)合降解并抑制靶基因表達(dá)。有研究表明在胃癌組織中微小RNA106b ( miR-106b) 上調(diào)表達(dá)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移［3］。惡性腫瘤的發(fā)生與癌基因及抑癌基因的活性狀態(tài)有關(guān)，殘疾基因同源物2( DAB2) 是一種抑癌基因并可在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要作用［4］。目前關(guān)于miR-106b 與DAB2 在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)研究相對(duì)較少，為此，本研究探討子宮內(nèi)膜癌組織中miR-106b 與DAB2 表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系，探究其預(yù)后評(píng)定價(jià)值。

1 資料與方法

1．1 一般資料

收集2010 年5 月—2015 年2 月本院手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜癌病例資料70 例( 觀察組) ，年齡( 36．2±2．6) 歲( 31～65 歲) ，均經(jīng)病理證實(shí)為子宮內(nèi)膜癌。收集臨床病理資料包括FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、肌層浸潤(rùn)、P53 及Ki67 表達(dá)等。按照FIGO 分期標(biāo)準(zhǔn)［5］分為I 期34 例，Ⅱ期21 例，Ⅲ期15例;根據(jù)組織內(nèi)膜癌分級(jí)法［6］分為G1 期16 例，G2期44 例，G3 期10 例。P53、Ki67 呈棕黃色或棕褐色顆粒標(biāo)記為陽(yáng)性，以陽(yáng)性細(xì)胞占每個(gè)視野下全部腫瘤細(xì)胞的平均比例作為量化指標(biāo):即P53，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽(yáng)性( +) ，＜10%為陰性( -) ;Ki67，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥14%為陽(yáng)性( +) ，＜14%為陰性( -) 。另選取同期于本院進(jìn)行子宮內(nèi)膜癌切除手術(shù)70 例患者的癌旁正常組織標(biāo)本為正常組，年齡( 36.6±3．3) 歲(32～71 歲) 。納入標(biāo)準(zhǔn): 患者術(shù)前未接受化療或放療以及激素治療，知情且簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):①患有多處原發(fā)性腫瘤;②患有其他腫瘤或重大疾病病史;③肝腎等重要器官嚴(yán)重?fù)p傷;④臨床資料不完整。兩組患者年齡比較無(wú)差異( P＞0．05) 。

1．2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

1．2．1 子宮內(nèi)膜組織中miR-106b、DAB2 表達(dá)檢測(cè)采用Trizol 法( 北京恩碩生物科技有限公司) 提取子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本總RNA，DEPC 水溶解RNA 并測(cè)定RNA 濃度及純度。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒( 天根生化科技( 北京) 有限公司) 將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照SYBR Green qRT-PCR 試劑盒( 北京恩碩生物科技有限公司) 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，其中miR-106b 上游引物序列為: 5’-TTTTCGCCCTTAGCGTGAAGA-3 ’， 下 游 引 物 序 列 為: 5 ’ - GAGGCAGTCGAAGCTCTCG -3’，以U6 為內(nèi)參基因，上游引物序列為: 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列為:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，DAB2 上游引物序列為: 5’-TGGACGATGTGCTCT ATGCC-3’，下游引物序列為: 5’-GGATGGTGATGGTTTGGTAG-3’，以β?actin 為內(nèi)參基因，上游引物序列為: 5’-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3’，下游引物序列為:5’-GTAGTTTCG TGGATGCCACAG-3’。qRT-PCR 反應(yīng)體系為15 μl，其中cDNA 1 μl，引物各0．5 μl，SYBR Green Mix 7．5 μl，RNase-free ddH2O5．5 μl。每個(gè)樣品為3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，在實(shí)時(shí)熒光定量RCR 儀上進(jìn)行反應(yīng)，程序設(shè)置為95 ℃10 min;95℃15s、60 ℃15s，72 ℃15s，共40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后將數(shù)據(jù)保存并對(duì)所得數(shù)據(jù)Ct 值進(jìn)行分析，采用2-ΔΔCt算法計(jì)算miR-106b 與DAB2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量，并分析miR-106b 與DAB2 表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系。

1．2．2 子宮內(nèi)膜組織中DAB2 蛋白表達(dá)檢測(cè) 按照免疫組化試劑盒( 美國(guó)Bioassay Technology 公司) 說(shuō)明書(shū)檢測(cè)組織中DAB2 蛋白表達(dá)。將子宮內(nèi)膜組織制作成石蠟切片，梯度脫水、PBS 清洗后置于檸檬酸鈉溶液( pH7．2～7．4) 中20 min 抗原修復(fù)，PBS 清洗后加入稀釋1:100 的DAB2 一抗( 上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司) 并置于4 ℃冰箱過(guò)夜，次日PBS沖洗標(biāo)本并滴加生物素標(biāo)記二抗( 北京九州天瑞卡機(jī)有限公司) ，37 ℃孵育30 min 后滴加DAB( 福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司) 顯色10 min，蘇木精復(fù)染后用蒸餾水清洗，滴加二甲苯后封片光學(xué)顯微鏡下觀察。

1．2．3 結(jié)果判定 DAB2 主要位于細(xì)胞質(zhì)，染色呈黃色、棕黃色、棕褐色，挑選每張切片較清晰的7 ～10個(gè)視野統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與染色程度綜合評(píng)判結(jié)果［7］: 陽(yáng)性細(xì)胞＜25%為0 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分。染色程度，未著色為0 分，黃色為1 分，棕黃色為2分，棕褐色為3 分。兩項(xiàng)相加之和為0 ～1 分為陰性( -) ，2～3 分為弱陽(yáng)性( +) ，4 ～5 分為陽(yáng)性( ++ ，≥6分為強(qiáng)陽(yáng)性( +++) ，將( +、++、+++) 作為陽(yáng)性表達(dá)組，( -)作為陰性表達(dá)組。

1．3 隨訪

所用患者均于本院建立資料并通過(guò)電話、門(mén)診等隨訪3 年，統(tǒng)計(jì)患者開(kāi)始治療到腫瘤進(jìn)展或死亡時(shí)間即無(wú)生存進(jìn)展期( PFS) 。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19．0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( 珋x±s) 表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用［n( %) ］表示，采用檢驗(yàn);Pearson 法進(jìn)行相關(guān)性分析;采用Kaplan-Meier 分析患者生存情況。以P＜0．05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 子宮內(nèi)膜組織中miR-106b、DAB2 表達(dá)

觀察組miR-106b 表達(dá)水平( 3．18±0．10) 高于正常組( 1．05±0．34) ，而DAB2 表達(dá)水平( 0．30±0.02)低于正常組( 1．03±0．05) ( P＜0．05) 。

2．2 子宮內(nèi)膜組織中DAB2 蛋白表達(dá)

免疫組化檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中DAB2 蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，DAB2 位于細(xì)胞質(zhì)，染色呈黃色、棕黃色、棕褐色。觀察組中DAB2 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低于正常組( P＜0．05) 。詳見(jiàn)表1。

2．3 miR-106b、DAB2 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

miR-106b 表達(dá)量中位值為2．12±0．25，高于中位值有42 例( 高表達(dá)) ，余28 例低于中位值( 低表達(dá)) 。臨床病理分析結(jié)果顯示，miR-106b 表達(dá)與FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、P53 及Ki67 有關(guān)，DAB2 表達(dá)與FIGO 分期、肌層浸潤(rùn)程度、P53 及Ki67 有關(guān)( P＜0．05) 。詳見(jiàn)表2。

表1 兩組子宮內(nèi)膜組織中DAB2 蛋白表達(dá)情況比較(例)

表2 觀察組內(nèi)膜組織miR-106b、DAB2 表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系［例(%)］

2．4 miR-106b 與DAB2 表達(dá)相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)性分析顯示，miR-106b 與DAB2 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)( r=-0．358，P=0．012) 。見(jiàn)圖1。

2．5 子宮內(nèi)膜癌組織中miR-106b、DAB2 表達(dá)與預(yù)后關(guān)系

Kaplan-Meier 曲線顯示miR-106b、DAB2 表達(dá)與PFS 相關(guān)，miR-106b 低表達(dá)組PFS( 40．0%) 高于高表達(dá)組(20．0%)，DAB2 陽(yáng)性表達(dá)組PFS(38．6%) 高于陰性表達(dá)組(21．4%) ( P＜0．05) ，見(jiàn)圖2。將影響子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素進(jìn)行Cox 多元回歸分析，結(jié)果顯示miR-106b、DAB2 表達(dá)、組織學(xué)分級(jí)及肌層浸潤(rùn)程度均是患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表3。

圖1 miR-106b 與DAB2 表達(dá)水平相關(guān)性分析

表3 子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析

圖2 miR-106b、DAB2 表達(dá)與PFS 的關(guān)系

3 討論

子宮內(nèi)膜癌根據(jù)發(fā)生原因可分為雌激素依賴型與非雌激素依賴型，前者主要源于子宮內(nèi)膜增生，后者包括子宮內(nèi)膜漿液性癌、黏液癌、腺鱗癌等［8］。目前臨床實(shí)踐中主要依據(jù)病理類型進(jìn)行診斷，但無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)估病理分期等腫瘤生物學(xué)特征，因此依靠特異性及敏感性較高的分子標(biāo)記物從而掌握腫瘤生物學(xué)行為具有重要臨床意義。miRNAs 可通過(guò)調(diào)控下游靶基因蛋白表達(dá)并介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄后，一個(gè)或多個(gè)共同調(diào)控蛋白編碼基因［9］。研究表明miRNAs 參與細(xì)胞增殖等細(xì)胞生命活動(dòng)過(guò)程并對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用［10］。探討子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移或侵襲有關(guān)的miRNAs 與靶基因，對(duì)早期診治及評(píng)估預(yù)后具有重要應(yīng)用價(jià)值。

miR-106b 位于人類7 號(hào)染色體且在編碼基因MCM7 的第13 個(gè)內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)，研究表明miR-106b在前列腺癌中上調(diào)表達(dá)并促進(jìn)癌細(xì)胞增殖即發(fā)揮促癌功能［11］。肝癌組織中miR-106b 高表達(dá)進(jìn)而促使E-Cadherin 等上皮或間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物下調(diào)表達(dá)從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖及侵襲［12］。在胃癌組織中miR-106b 上調(diào)表達(dá)而靶基因Smad7 下調(diào)表達(dá)，通過(guò)促使腫瘤細(xì)胞增殖進(jìn)而參與胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程［13］。近來(lái)相關(guān)研究表明乳腺癌組織中miR-106b 上調(diào)表達(dá)可活化TGF?β 通路從而促使上皮間質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)化導(dǎo)致癌癥發(fā)生［14］。目前關(guān)于miR-106b 在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)及與臨床病理關(guān)系的研究相對(duì)較少。

本研究檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌組織miR-106b 的表達(dá)水平顯著高于正常組織，說(shuō)明miR-106b 可能參與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲及遷移過(guò)程。進(jìn)一步分析miR-106b 表達(dá)與患者臨床病理特征關(guān)系顯示，miR-106b表達(dá)與FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、P53 及Ki67 呈正相關(guān)，且P53、Ki67 陽(yáng)性表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的生物學(xué)行為及預(yù)后不良相關(guān)［15］。說(shuō)明miR-106b 表達(dá)與腫瘤組織分化、惡化程度密切相關(guān)，推測(cè)其可作為診斷子宮內(nèi)膜癌的分子標(biāo)記物。

DAB2 是一種磷蛋白，研究表明miR-106b 可調(diào)控靶蛋白DAB2 表達(dá)而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖分化［16］。DAB2 可參與絲裂原信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，同時(shí)DAB2 與結(jié)合蛋白相互作用可參與胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶等多種腫瘤相關(guān)信號(hào)途徑［17］。有報(bào)道證實(shí)在前列腺癌中DAB2 表達(dá)下調(diào)從而影響血管生成及腫瘤細(xì)胞存活或凋亡等生物學(xué)過(guò)程［18］。研究表明DAB2 是一種抑癌基因并可在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用，肝癌組織中DAB2下調(diào)表達(dá)并與腫瘤病理分級(jí)及預(yù)后相關(guān)［19］。本研究檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌組織中DAB2 表達(dá)顯著低于正常組，且免疫分析DAB2 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低于正常組，說(shuō)明DAB2 參與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生及發(fā)展。臨床病理特征結(jié)果顯示DAB2 表達(dá)與FIGO 分期、肌層浸潤(rùn)程度、P53 及Ki67 正相關(guān)，說(shuō)明DAB2 表達(dá)可能作為判斷病情發(fā)展的參考指標(biāo)。Pearson 相關(guān)性分析顯示出miR-106b 與DAB2 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明子宮內(nèi)膜癌中miR-106b 可通過(guò)下調(diào)靶基因DAB2 表達(dá)促使腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲導(dǎo)致病情惡化。對(duì)子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后分析顯示，miR-106b 低表達(dá)組PFS 高于高表達(dá)組，DAB2 陽(yáng)性表達(dá)組PFS 高于陰性表達(dá)組。將影響子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素進(jìn)行Cox 多元回歸分析，結(jié)果顯示miR-106b、DAB2 表達(dá)均是患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，說(shuō)明二者不僅與子宮內(nèi)膜癌預(yù)后相關(guān)，且均是患者生存時(shí)間的危險(xiǎn)因素。提示miR-106b、DAB2 表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)，二者可預(yù)測(cè)病情嚴(yán)重程度并可作為評(píng)估預(yù)后的有效指標(biāo)。

綜上所述，子宮內(nèi)膜癌組織中miR-106b 上調(diào)表達(dá)，而DAB2 下調(diào)表達(dá)，二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系且均與患者臨床病理特征及預(yù)后相關(guān)，二者均可作為臨床診斷子宮內(nèi)膜癌及評(píng)估患者預(yù)后的分子標(biāo)記物。本研究也存在不足之處，miR-106b 與DAB2 在子宮內(nèi)膜癌中的生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步研究。