劉東伯 楊 麗 周洋媚 陳春麗

1．華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院( 武漢，430030) ;2．湖北省十堰市太和醫(yī)院

近年來關(guān)于高遷移率族蛋白B1( HMGB1) 、人跨膜蛋白Notch1 和增殖細(xì)胞核抗原( PCNA) 的研究成為學(xué)術(shù)界的熱門話題，多篇報(bào)道認(rèn)為三者可能參與了惡性腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移過程［1-3］。然而目前關(guān)于3 種細(xì)胞因子表達(dá)相關(guān)性的研究較少，本研究對(duì)宮頸鱗癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變( CIN) 及正常宮頸組織中上述3 種蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，探究其在不同組織間的表達(dá)差異、臨床病理特征影響及與宮頸癌組織相關(guān)性。

1 資料和方法

1．1 研究對(duì)象

選取2015 年1 月—2018 年1 月于本院婦產(chǎn)科行全子宮或次全子宮切除術(shù)且病理為宮頸鱗癌的患者60 例( 宮頸癌組) ，患者住院期間無嚴(yán)重并發(fā)癥，年齡( 49．6±5．2) 歲( 26～78 歲) ;TNM 分期為Ⅰ期19例、Ⅱ期21 例、Ⅲ期20 例; 腫瘤分化程度為低分化26 例，中分化28 例，高分化6 例。另取本院同期確診為宮頸上皮內(nèi)瘤變( CIN) Ⅲ期患者40 例( CIN組) ，年齡( 50．3±5．4) 歲( 24 ～77 歲) ;參加體檢的健康志愿者20 例( 對(duì)照組) ，年齡( 50．8±5．6) 歲( 21 ～75 歲) 。3 組 年 齡 無 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 差 異( t = 2．435，P ＞0.05) ，具有可比性。本研究經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過，患者及志愿者均對(duì)本次研究知情并簽署同意書。

1．2 儀器及試劑

1．3 方法

取宮頸癌和CIN 兩組病灶組織及對(duì)照組正常宮頸組織，經(jīng)固定、脫水透蠟、包埋、切片烘干。于微波下采用枸櫞酸鹽緩沖液修復(fù)抗原，加入3%過氧化氫40min、滅活內(nèi)源性酶，PBS 洗片3 次，滴加山羊血清封閉，時(shí)間30min。依次滴加兔抗人HMGB1抗體( 1:100) ，大鼠抗人Notch1( 1:100) 和PCNA 單克隆抗體( 1:100) ，抗體于4℃環(huán)境下過夜，甩除一抗，重復(fù)PBS 洗片3 次( 5min/次) ，滴加二抗( 1:100) ，室溫下孵育30min，洗片后DAB 染色，脫水透明，封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。用宮頸鱗癌作HMGB1、Notch1 和PCNA 的陽性對(duì)照，PBS 代替一抗作陰性對(duì)照。

1．4 顯微鏡觀察標(biāo)準(zhǔn)

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18．0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。計(jì)量資料用( 珋x±s) 表示，組間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用百分率表示，采用檢驗(yàn); 分析HMGB1、Notch1 和PCNA 表達(dá)程度與臨床病理特征的關(guān)系采用秩和檢驗(yàn);采用Spearman 法行相關(guān)性分析。以P＜0．05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 各組宮頸組織蛋白表達(dá)情況比較

HMGB1、Notch1 和PCNA 均在細(xì)胞核中表達(dá)，表現(xiàn)為深褐色或棕黃色顆粒，且宮頸癌組陽性表達(dá)率最高，CIN 組次之，對(duì)照組最低( P 均＜0．05) 。見表1，圖1～3。

圖1 宮頸組織HMGB1 表達(dá)( ×400)

圖2 宮頸組織Notch1 表達(dá)

圖3 宮頸組織PCNA 表達(dá)( ×400)

2．2 宮頸癌組織中蛋白表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

宮頸癌組不同年齡段患者宮頸組織中HMGB1、Notch1 和PCNA 表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而分化程度低、TNM 分期高的組織中上述細(xì)胞因子的陽性表達(dá)程度相對(duì)較高( P 均＜0．05) 。見表2、3、4。

表2 宮頸癌組織中HMGB1 表達(dá)程度與臨床病理特征比較［例(%)］

表3 宮頸癌組織中Notch1 表達(dá)程度與臨床病理特征比較［例(%)］

表4 宮頸癌組織中PCNA 表達(dá)程度與臨床病理特征比較［例(%)］

2．3 宮頸癌組織中3 種蛋白表達(dá)的相關(guān)性

對(duì)60 例宮頸鱗癌組織中HMGB1、Notch1 和PCNA 的表達(dá)情況行Spearman 相關(guān)性分析，3 者在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)兩兩均呈正相關(guān)( P 均＜0．05) 。見表5。

表5 各蛋白在宮頸鱗癌中表達(dá)的相關(guān)性(例)

3 討論

子宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，近年發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)［5］。隨著宮頸細(xì)胞學(xué)篩查的普及，癌前病變和宮頸癌得以在早期發(fā)現(xiàn)、診斷和治療，其發(fā)病率和病死率也逐漸下降［6-7］。盡管如此，宮頸癌的病死率仍高達(dá)35%，其中絕大部分患者在早期未能通過篩查發(fā)現(xiàn)，最終死于惡性腫瘤轉(zhuǎn)移，因此早期診斷對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義［8］。宮頸癌的發(fā)病過程較漫長(zhǎng)，需要?dú)v經(jīng)慢性炎癥、非典型細(xì)胞增生、CIN 等階段形成原位癌，在這個(gè)過程中，多種原癌基因和抑癌基因參與了調(diào)控［9］。近年來關(guān)于HMGB1、Notch1 和PCNA 的研究成為熱點(diǎn)，HMGB1 可在凝膠電泳過程中快速遷移，被認(rèn)為是重要的致炎細(xì)胞因子。此外有研究認(rèn)為HMGB1 具有促進(jìn)宮頸癌HeLa 細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的作用［10］。Notch受體有4 個(gè)類型，Notch1 信號(hào)通路可維持細(xì)胞增殖、分化和凋亡三者間的平衡，當(dāng)相應(yīng)染色體發(fā)生易位后，可導(dǎo)致該蛋白的胞外區(qū)丟失，蛋白整體失去原有功能，胞內(nèi)區(qū)因獲取組成性活性而發(fā)揮致癌作用［11］。PCNA 是細(xì)胞核內(nèi)合成的一種蛋白質(zhì)，其含量的改變可反映DNA 的合成情況，因此可視為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖的指標(biāo)［12-13］。目前關(guān)于三者在宮頸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性報(bào)道較少，探究三者關(guān)系具有較高的臨床意義。

從本次研究的結(jié)果來看，宮頸癌組HMGB1、Notch1 和PCNA 的陽性表達(dá)率均高于另外兩組，而對(duì)照組最低，與張瑞青［14］研究結(jié)果一致，證實(shí)三者在宮頸癌形成過程中發(fā)生了變化。HMGB1、Notch1和PCNA 在宮頸癌中的表達(dá)與年齡無關(guān)，而與分化程度和TNM 分期有關(guān)，隨分化程度下降和TNM 分期增加，表達(dá)程度提高。HMGB1、Notch1 和PCNA在表達(dá)上兩兩間均呈正相關(guān)。根據(jù)上述結(jié)果推斷三者均參與了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)過程，同時(shí)三者互相起到協(xié)同作用，但具體協(xié)同機(jī)制需進(jìn)一步探究［15］。本研究的主要不足為以下兩點(diǎn):①除正常宮頸和宮頸癌組織外，本研究?jī)H選取了CIN Ⅲ期的患者，未來的觀察中可納入宮頸慢性炎癥、不典型細(xì)胞增生和CIN Ⅰ～Ⅱ期的患者，以加強(qiáng)對(duì)結(jié)果的論證;②本研究限于病例數(shù)量，僅將臨床上最常見的鱗癌納入研究，因此上述結(jié)果是否適用于腺癌、腺鱗癌等類型的宮頸癌仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，與正常宮頸和CIN 組織相比，宮頸癌組織中HMGB1、Notch1 和PCNA 的表達(dá)顯著提高，其表達(dá)程度隨分化程度下降、TNM 分期增加而提高，提示3 種蛋白參與了宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)過程，干擾其異常表達(dá)有望成為治療宮頸癌的新思路和途徑。