周建麗 王 穎 曾文滔 梅 云

(南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，南京 211166)

模型鼠的大量涌現(xiàn)使得動(dòng)物交流變得頻繁，增加科研合作的同時(shí)也給飼養(yǎng)環(huán)境及微生物安全帶來風(fēng)險(xiǎn)，多數(shù)動(dòng)物房對活體動(dòng)物采用生物凈化或是引進(jìn)冷凍精子和胚胎[1]，但對于少量品系的運(yùn)輸還是存有弊端，公共交通工具對活體動(dòng)物和液氮罐實(shí)行禁運(yùn)，而專門機(jī)構(gòu)的運(yùn)輸價(jià)格較昂貴。因此，簡單易行的運(yùn)輸方法對小鼠品系交流有較好的實(shí)用意義。此外，部分基因模型鼠由于基因表達(dá)或?qū)嶒?yàn)使用等原因造成種鼠數(shù)量少，期間出現(xiàn)小鼠病重或意外死亡，對該品系往往是毀滅性的，而這些品系雄鼠精子多數(shù)仍具備可受精能力，如果合理保存小鼠尸體并借助輔助生殖技術(shù)可挽回品系[2-4]，避免品系的丟失和資源的浪費(fèi)。小鼠的運(yùn)輸及突發(fā)性死亡的應(yīng)急方案被越來越多的實(shí)驗(yàn)者所關(guān)注。

輔助生殖技術(shù)在小鼠中應(yīng)用廣泛[5-9]，有報(bào)道對4 ℃冷藏20多天的精子經(jīng)單精子注射(ICSI)獲得了健康后代，冷藏24 h內(nèi)的精子可得到IVF后代[10-11]，附睪尾攜帶方便，經(jīng)IVF或ICSI得到后代能有效避免活體攜帶病原微生物的感染風(fēng)險(xiǎn)[1]，同時(shí)減少了種資源冷凍復(fù)蘇的繁瑣流程。目前關(guān)于配子冷藏的文獻(xiàn)多見ICR、B6D2F1等封閉群或雜交品系，周齡也是剛成年的小鼠[2]，本文對5月齡C57BL/6 J雄鼠尸體4 ℃冷藏24、48、72 h和96 h后進(jìn)行IVF，以期為同業(yè)人員的小鼠品系運(yùn)輸和意外死亡品系恢復(fù)等提供短期保存方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境

5月齡C57BL/6 J雄鼠、3～4周齡體質(zhì)量9～14 g 的C57BL/6 J雌鼠和2～3月齡ICR雌鼠，均購自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SCXK(蘇)2016-0002)。雄鼠單只飼養(yǎng)，雌鼠適應(yīng)光照周期1周，飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)均在南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境(SYXK(蘇)2016-0016)，環(huán)境溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，光照周期12 L:12 D，光照時(shí)間 08:00—20:00。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要儀器與耗材

生物安全柜(Esco，class II type A2)、冰箱(Haier)、CO2培養(yǎng)箱(Binder)、體視顯微鏡(Olympus)、冷光源(Olympus)、移植器械1套。促卵泡液(Equine chorionic gonadotropin，eCG，PMSG)、促排卵液(Human chorionic gonadotropin，HCG)、獲能液(Modified KrebsRinger bicarbonate solution，TYH)[5,12]、受精液(Human tubal fluid,HTF)[5]、培養(yǎng)液M16(Sigma， M7292)、石蠟油(Sigma，M8410)、35 mm培養(yǎng)皿(Corning，430165)、φ2.5 mm毛細(xì)管、胚胎測試水(H2O；Sigma，W1503)、溶液配制試劑全部購置于Sigma。

1.3 配子分組準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)組雄鼠每3只一組，分為4組，脫頸處死后，整只裝入自封袋放于4 ℃冰箱冷藏，分別冷藏24、48、72 h和96 h后取附睪尾IVF，對照組雄鼠處死后立即取附睪尾IVF。雌鼠于16:30腹腔注射5 IU/只 PMSG，48 h 后腹腔注射5 IU/只HCG促排卵。

1.4 體外受精與培養(yǎng)

按Takeo和Nakagata[5]及劉科等[6]的方法進(jìn)行精子采集、獲能和體外受精。φ2.5 mm玻璃管拉制洗卵針，吸取精卵復(fù)合體在M16培養(yǎng)液中反復(fù)吹洗3遍，去除碎裂、未成熟等不具受精能力的卵子，體視顯微鏡下統(tǒng)計(jì)受精卵數(shù)目，移入干凈的M16培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.5 胚胎移植及附植率統(tǒng)計(jì)

每只ICR受體鼠單側(cè)輸卵管移植6枚2細(xì)胞胚胎，第13.5天處死孕鼠記錄胚胎附植率，受體制備及胚胎移植參見文獻(xiàn)方法[8]。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

χ2獨(dú)立性檢驗(yàn)、Fisher確切概率法分析IVF受精率，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 IVF受精率

受精率隨冷藏時(shí)間急劇下降，對照組受精率為95%、冷藏24～96 h分別為70.3%、24.7%、1.6%、0%(圖1)，72 h和96 h冷藏后不能用作IVF，對照組與冷藏24、48 h受精率差異極顯著(P<0.01)(表1)。

圖1 受精率趨勢Fig.1 Tendency of fertilization rate

組別GroupsMII卵/枚Number of MII eggs受精卵/枚Number of fertilized eggs受精率/%Rate of fertilized24 h14510270.3??48 h1944824.7??對照組Control20719795

注：**表示與對照組差異極顯著(P<0.01)

Note：**Extremely significant difference(P<0.01)

2.2 組內(nèi)受精率比較

冷藏24 h組受精率分別為73.0%、60.0%和77.0%，組內(nèi)差異極顯著(P<0.01)，但受精率均達(dá)到50%以上，可用于冷藏IVF。48 h組有1只雄鼠精子的受精率達(dá)到50%以上，受精率分別為3.7%、0%和55.4%，組內(nèi)差異極顯著(P<0.01)，組內(nèi)波動(dòng)很大，不可用于冷藏IVF。對照組受精率為94.4%、93.7%和97.1%，組內(nèi)無顯著性差異(表2)。

表2 冷藏24 h、48 h與對照組組內(nèi)受精率比較Table 2 The comparison of the fertilization rate in therefrigerated groups and the control group

注：*表示組內(nèi)差異顯著(P<0.05)、**表示組內(nèi)差異極顯著(P<0.01)

Note：*Significant difference(P<0.05)、**Extremely significant difference(P<0.01)

2.3 胚胎發(fā)育能力

各實(shí)驗(yàn)組受精卵均發(fā)育至2 細(xì)胞胚胎。將24 h組和對照組得到的2細(xì)胞胚胎分別單側(cè)輸卵管移植5只受體，分別妊娠4只、5只，第13.5天獲得胎兒15只(60%)和20只(66%)，證明冷藏精子對早期受精卵發(fā)育無影響(表3、圖2、圖3)。

表3 胚胎發(fā)育能力Table 3 The ability of embryonic development

圖2 24 h組移植第13.5天的附植胚胎Fig.2 The implantation embryos for 13.5 days in 24 h group

圖3 對照組移植第13.5天附植胚胎Fig.3 The implantation embryos for 13.5 days in control group

3 討論

結(jié)果顯示，精子冷藏24 h的受精率雖然與對照組受精率差異顯著，但單只受精率均可達(dá)到50%以上，完全具備品系恢復(fù)的能力；冷藏48 h 后仍具備IVF能力，但組內(nèi)差異顯著，僅1只鼠達(dá)到50%以上；冷藏72 h僅個(gè)別卵子受精；冷藏96 h顯微鏡下觀察仍有很大一部分活動(dòng)精子，但已不具備受精能力。各組所得受精卵全部可發(fā)育至2細(xì)胞胚胎，胚胎移植后能正常附植，證明精子經(jīng)冷藏后對胚胎發(fā)育沒有影響。受精失敗的主要原因是隨著冷藏時(shí)間增加對精子的活力影響增大，精子運(yùn)動(dòng)速度和尾部擺動(dòng)幅度都相應(yīng)減小，精子獲得動(dòng)能的時(shí)間也相應(yīng)增加，96 h組精子需要在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 min左右才出現(xiàn)游動(dòng)精子。對于長時(shí)間冷藏的小鼠只有通過透明帶打孔或是ICSI才能得到后代[10-11]。

所有保存方法對精子的傷害是不可避免的[10]，Takeo等曾對比了器官保存液(Lifor)、石蠟油、M2和CPS-l在4～8 ℃冷藏附睪尾對精子受精能力的影響，發(fā)現(xiàn)72 h后Lifor較其它組效果好[4]，證明不同的保存液以及留樣方式對精子活力具有一定影響，本實(shí)驗(yàn)考慮到飼養(yǎng)過程中病重鼠或意外死亡做的緊急處理，采用整鼠冷藏后取精子IVF，腔內(nèi)臟器腐敗對附睪內(nèi)精子可能也存在一定影響，有條件的設(shè)施可采用Lifor輔助保存。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明大周齡小鼠在冷藏24 h內(nèi)具備穩(wěn)定IVF受精能力，為小鼠運(yùn)輸和意外死亡提供一個(gè)安全便捷的處理方案。