賈欣 代潔瓊 喬巧玉 趙欣 王志華 關(guān)曉雅 杜振瑩 張宇

【摘要】 目的：觀察腳掌注射不同濃度完全弗氏佐劑（complete Freunds adjuvant，CFA）產(chǎn)生的不同強(qiáng)度的傷害刺激對(duì)大鼠痛感受和痛情緒反應(yīng)程度的影響。方法：福爾馬林誘導(dǎo)的條件性位置回避（conditioned place avoidance，CPA）的行為測(cè)試近來被用于評(píng)估痛情緒反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用另一種炎性致痛物質(zhì)CFA在大鼠的腳掌皮下注射使之產(chǎn)生持續(xù)性炎性痛，誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生條件性位置回避（conditioned place avoidance，C-CPA）反應(yīng)。根據(jù)在大鼠的腳掌皮下注射不同濃度的CFA將大鼠分為正常（Naive）組，生理鹽水（NS）組，1/5 CFA組，1/3 CFA組，1/2 CFA組，之后分別檢測(cè)各組大鼠的熱縮足潛伏期（paw withdrawal latency，PWL）和C-CPA反應(yīng)。結(jié)果：1/3 CFA組和1/2 CFA組匹配后熱縮足潛伏期與匹配前比較，均明顯減小，即痛閾下降，且兩組匹配前與匹配后的差值與生理鹽水組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；1/3 CFA組的下降值小于1/2 CFA組（P<0.05）；1/2 CFA組在匹配后痛側(cè)停留的時(shí)間明顯縮短，且回避分?jǐn)?shù)與生理鹽水組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：CFA所誘導(dǎo)的PWL反應(yīng)和CPA反應(yīng)的程度與CFA的注射濃度有關(guān)，從行為上證實(shí)大鼠痛情緒與痛感受的產(chǎn)生存在不同的機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】 完全弗氏佐劑； 條件性位置回避； 前扣帶皮層； 痛情緒

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.29.001

慢性疼痛是一個(gè)世界性的醫(yī)療難題，它既是與大多數(shù)疾病相伴生的臨床癥狀，同時(shí)本身也是一種疾病[1]?；颊叱嗽馐芴弁丛斐傻娜怏w傷害之外，其導(dǎo)致的心理、精神傷害和社會(huì)并發(fā)癥也成了一個(gè)重大的負(fù)擔(dān)[2-3]。國(guó)際疼痛協(xié)會(huì)對(duì)疼痛的最新定義為“疼痛是一種與組織損傷或潛在的組織損傷相關(guān)的感覺、情感、認(rèn)知和社會(huì)維度的痛苦體驗(yàn)”[4]。這一定義將疼痛分為感覺、情感、認(rèn)知和社會(huì)四個(gè)維度，其中痛感覺主要感受疼痛刺激的性質(zhì)、位置、強(qiáng)度等，痛情緒則指?jìng)π源碳ひ鸬慕箲]、恐懼、厭惡等情緒反應(yīng)[5]。痛情緒可分兩個(gè)階段：一是痛不愉快感（feeling of unpleasantness），它是對(duì)痛刺激的即時(shí)反應(yīng)，又稱原發(fā)性不愉快（primary unpleasantness）；二是繼發(fā)性不愉快（secondary unpleasantness），是一種疼痛長(zhǎng)期作用引起的情緒反應(yīng)，它和接受疼痛刺激時(shí)所處的環(huán)境、疼痛對(duì)將來生活的影響、慢性疼痛引發(fā)的焦慮恐懼等密切相關(guān)，其涉及疼痛、認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶等因素，需要大腦的高級(jí)中樞對(duì)這些信息進(jìn)行整合[6]。與痛感受相比，介導(dǎo)痛情緒的神經(jīng)傳導(dǎo)通路及其產(chǎn)生的中樞機(jī)制大為不同。

研究表明軀體感覺皮質(zhì)（S1和S2）和島葉皮層被認(rèn)為是編碼痛感覺，包括性質(zhì)（刺痛、灼熱痛或心絞痛）、定位和強(qiáng)度[7-9]。前額區(qū)域和邊緣系統(tǒng)（ACC、PFC、杏仁核、VTA和伏隔核）編碼情緒和動(dòng)機(jī)反應(yīng)，并且和痛的情感和聯(lián)系方面是有關(guān)聯(lián)的[7，10-12]。和臨床研究相反，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中很難去評(píng)價(jià)痛情緒。最近，各種各樣的方法已經(jīng)被應(yīng)用評(píng)價(jià)持續(xù)性疼痛，在這些方法中，條件性位置回避（CPA）能夠去評(píng)價(jià)大鼠的痛情緒[13]。在此基礎(chǔ)上筆者實(shí)驗(yàn)室通過使用自制的CPA裝置來檢測(cè)大鼠的痛情緒，使用不同濃度的完全弗氏佐劑（CFA）作為炎性致痛物質(zhì)來誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生慢痛反應(yīng)，以此來觀察腳掌注射不同濃度CFA產(chǎn)生的不同強(qiáng)度的傷害刺激對(duì)大鼠痛感受和痛情緒反應(yīng)程度的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 體重250～270 g的成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，購(gòu)于北京海淀興旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)。大鼠分籠飼養(yǎng)于動(dòng)物房，每籠4只，動(dòng)物房室溫維持在（22±1）℃，相對(duì)濕度40%～60%，大鼠能夠自由進(jìn)食、進(jìn)水，晝夜循環(huán)光照，各12 h，大鼠領(lǐng)養(yǎng)回來適應(yīng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)大鼠左側(cè)后腳掌注射不同濃度的CFA/NS，將大鼠分為5組：正常（Naive）組（7只），生理鹽水（NS）組（6只），1/5 CFA組（6只），1/3 CFA組（7只），1/2 CFA組（7只）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 熱板刺激儀（life science），條件性位置回避裝置（自制），完全弗氏佐劑（CFA，sigma），嚙齒類動(dòng)物固定裝置，NeuroMotive軟件（USA），ANY-maze軟件（USA）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立大鼠持續(xù)性疼痛模型 配制不同濃度的CFA：CFA原液與0.9%氯化鈉注射液分別按照0.25︰1、0.5︰1、1︰1的體積比混合成乳化狀態(tài)。將大鼠固定于嚙齒類動(dòng)物固定裝置上，抽取上述配好的混合液0.08 mL皮下注射于大鼠的左側(cè)后腳掌。同時(shí)左側(cè)后腳掌注射0.08 mL的0.9%氯化鈉注射液作為對(duì)照。

1.2.2 痛行為和痛情緒的檢測(cè) （1）檢測(cè)大鼠對(duì)熱痛刺激的腳掌回縮潛伏期（PWL）。使用熱板刺激儀進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谀_掌注射CFA的前1 d和第2天條件性位置回避（CPA）行為測(cè)完后進(jìn)行。先將大鼠放入熱板刺激儀的有機(jī)玻璃罩內(nèi)適應(yīng)30 min，后取出，將熱板升溫至50 ℃，再次將大鼠放入有機(jī)玻璃罩內(nèi)，從大鼠腳掌接觸熱板開始計(jì)時(shí)，大鼠出現(xiàn)舔后足或抬起即縮足反應(yīng)時(shí)計(jì)時(shí)停止，此時(shí)間即為大鼠腳掌回縮潛伏期（paw withdraw latency，PWL）。每只大鼠測(cè)量3次，中間間隔15～20 min，之后取3次的平均值。（2）CPA反應(yīng)的檢測(cè)。通過條件性位置回避實(shí)驗(yàn)來反映大鼠的痛情緒反應(yīng)。條件性位置回避的建立與檢測(cè)：①自制條件性位置回避裝置[14-15]，在進(jìn)行條件性位置回避誘導(dǎo)時(shí)，隨機(jī)設(shè)置其中一側(cè)為非CFA匹配室即非痛環(huán)境，而另一側(cè)則與致痛劑CFA注射進(jìn)行耦合，稱之為CFA匹配室，即痛環(huán)境。②CPA的檢測(cè)：分三天進(jìn)行，第一天，稱重：選取符合體重的SD雄性大鼠（250～270 g），測(cè)CPA的基礎(chǔ)值（baseline）：暗室適應(yīng)30 min，后放入CPA裝置自由活動(dòng)

10 min，用軟件分析大鼠在兩側(cè)的停留時(shí)間。第二天：暗室適應(yīng)30 min，后與非痛環(huán)境耦合30 min，左側(cè)后腳掌皮下注射不同濃度的CFA/NS；CFA注射后休息120 min，之后置于暗室適應(yīng)30 min，再進(jìn)行痛環(huán)境耦合30 min。第三天：同第一天，暗室適應(yīng)30 min，后放入CPA裝置自由活動(dòng)10 min，用軟件分析大鼠在痛環(huán)境和非痛環(huán)境的停留時(shí)間。第三天痛側(cè)停留的時(shí)間減去第一天痛側(cè)停留時(shí)間即為回避分?jǐn)?shù)，值越大代表回避程度越大，大鼠產(chǎn)生的痛情緒越明顯。該方法的流程圖見圖1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布的采用非參數(shù)檢驗(yàn)，用GraphPad Prism 5.0軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 注射不同濃度的CFA后大鼠的熱痛反應(yīng)比較 Naive組、NS組和1/5CF A組第一天和第三天的腳掌回縮潛伏期比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），1/3 CFA組和1/2 CFA組第一天與第三天的腳掌回縮潛伏期比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且第三天均顯著減小，即熱痛閾降低。1/3 CFA組和1/2 CFA組匹配前與匹配后的差值與NS組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)（P<0.05），且1/3 CFA組下降值明顯小于1/2 CFA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖2、表1。

2.2 注射不同濃度的CFA后大鼠的CPA反應(yīng) 大鼠左側(cè)腳掌注射不同濃度的CFA使得大鼠在痛環(huán)境匹配前后痛側(cè)環(huán)境的停留時(shí)間發(fā)生變化，Naive組、NS組、1/5 CFA組和1/3 CFA組匹配前在痛側(cè)環(huán)境的停留時(shí)間和匹配后的停留時(shí)間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），1/2 CFA組匹配前在痛側(cè)環(huán)境的停留時(shí)間和匹配后的停留時(shí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且匹配后在痛側(cè)停留的時(shí)間明顯縮短。1/2 CFA組的回避分?jǐn)?shù)與NS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Naive組、NS組、1/5 CFA組和1/3 CFA組的回避分?jǐn)?shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2、圖3。

3 討論

慢性持續(xù)性疼痛作為一種對(duì)經(jīng)濟(jì)、社會(huì)產(chǎn)生重大影響的疾病，一直備受關(guān)注。長(zhǎng)久以來慢性疼痛給患者帶來的不僅是難以忍受的疼痛感受，而且還會(huì)產(chǎn)生更為嚴(yán)重的影響人們身心健康的負(fù)性情緒[16]。Harkines等[17]采用Eysenek and Eysenek問卷法對(duì)105個(gè)肌筋膜疼痛功能障礙（MPD）患者進(jìn)行研究，分別觀察兩種相反的性格對(duì)痛感覺、痛情緒的影響，結(jié)果顯示痛感覺和痛情緒可能存在分離、并行和序次的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)通路。上行傳導(dǎo)束有兩大系統(tǒng)其一是由腦干內(nèi)測(cè)區(qū)上行的，經(jīng)過舊脊丘束、脊髓中腦束、脊髓臂旁-杏仁束、脊髓臂旁-下丘腦束和脊髓下丘腦束，它們主要傳遞痛情感信息；另一個(gè)是位于腦干外側(cè)區(qū)的，經(jīng)過新脊丘束、脊頸束和脊髓背側(cè)柱，主要傳遞痛的感覺分辨信息[18]。人們對(duì)痛感覺的研究在多個(gè)方面都取得了進(jìn)展，但對(duì)痛情緒的研究卻相對(duì)較慢。痛感覺誘發(fā)痛情緒有著比較明確的解剖結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和共同的物質(zhì)基礎(chǔ)[19]。在此基礎(chǔ)上筆者所在實(shí)驗(yàn)室通過使用自制的CPA裝置來檢測(cè)大鼠的痛情緒，由于CPA能檢測(cè)到與痛直接相關(guān)的情緒改變，并且沒有進(jìn)一步的傷害性刺激，因此越來越多的研究者認(rèn)同這一行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方案[15]。實(shí)驗(yàn)室前期證實(shí)了CFA與NS按照體積比為1︰1混合，皮下注射入大鼠左側(cè)后腳掌后，可以誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生CPA反應(yīng)，即使大鼠對(duì)痛環(huán)境產(chǎn)生厭惡，也使得大鼠的痛行為發(fā)生改變。因此本實(shí)驗(yàn)主要探討腳掌注射不同濃度CFA產(chǎn)生的不同強(qiáng)度的傷害刺激對(duì)大鼠痛感受和痛情緒反應(yīng)程度的影響。

在實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)者通過給大鼠的左側(cè)后腳掌注射不同濃度的CFA，檢測(cè)大鼠的熱縮足潛伏期及CPA反應(yīng)。痛感覺檢測(cè)的結(jié)果顯示，1/3 CFA組、1/2 CFA組與其他組相比，熱痛閾都明顯下降，1/2 CFA組的下降值更明顯，說明這兩個(gè)濃度的CFA可以使大鼠對(duì)熱刺激的敏感性增加；痛情緒結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度組即1/2 CFA組與其他組相比，產(chǎn)生了CPA反應(yīng)，即引起了大鼠的痛情緒反應(yīng)。1/3 CFA組雖然產(chǎn)生了痛感覺，但其強(qiáng)度不足以引起痛情緒，但更高濃度CFA的作用能同時(shí)誘導(dǎo)痛感受和痛情緒的發(fā)生。說明痛感受的程度與傷害性刺激的程度相關(guān)，痛情緒的強(qiáng)弱也與傷害性刺激的程度有關(guān)，而同樣的傷害性刺激，痛感受和痛情緒產(chǎn)生的閾值是不同的。這也從另一個(gè)角度說明，痛感受和痛情緒反應(yīng)雖然都來源于同樣的傷害性刺激，但它們卻是通過不同的傳導(dǎo)途徑和機(jī)制產(chǎn)生的。

致謝：本實(shí)驗(yàn)在山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系完成，感謝各位老師和同學(xué)們?cè)趯?shí)驗(yàn)中對(duì)我的幫助。

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（收稿日期：2018-05-07） （本文編輯：張爽）