段麗娟，李育合，謝小榮，孟祥玉，戴于棟，金學(xué)敏，高建軍

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胰酶激活的E型肉毒毒素及其類毒素免疫原性研究

段麗娟，李育合，謝小榮，孟祥玉，戴于棟，金學(xué)敏，高建軍

730046 蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司血清室

胰酶激活 E 型肉毒毒素，并研究其類毒素免疫原性。

胰酶激活 E 型肉毒毒素，脫毒后制備類毒素，免疫家兔，與常規(guī)方法制備的 E 型肉毒類毒素比較免疫原性。

胰酶激活 E 型肉毒毒素的最佳條件為胰酶濃度0.5%、激活時(shí)間 45 min、pH 6.0、溫度37 ℃，在此條件下可提高毒素毒力 1000 倍，但其類毒素免疫原性與常規(guī)方法無(wú)顯著性差異。

胰酶激活 E 型肉毒毒素，可大幅度提高毒素毒力，但并未改變其免疫原性。

胰酶； 類毒素類； 免疫原性； E 型肉毒毒素

肉毒毒素（botulinum toxin）是由厭氧的肉毒梭菌（clostridium botulinum）在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的一種細(xì)菌外毒素，它能引起以運(yùn)動(dòng)神經(jīng)麻痹癥狀為主的死亡率極高的中毒性疾病。肉毒梭菌及其毒素根據(jù)毒素抗原性的不同，可分為 A、B、C、D、E、F、G 七個(gè)型。其中 A、B、E 是人類罹患肉毒中毒的主要型別，F(xiàn) 型僅有少數(shù)幾起人中毒的報(bào)道，而 G 型至今尚無(wú)致人中毒的確鑿證據(jù)。C、D 型除個(gè)別病例外，主要是牲畜和禽類中毒的病原[1]。在我國(guó)，E 型肉毒中毒在青海省等青藏高原地區(qū)多有發(fā)生，中毒癥狀一般為視覺(jué)模糊、呼吸困難、眼瞼下垂、吞咽困難及全身乏力等[2-3]。對(duì)于肉毒毒素中毒的治療，通常用抗毒素來(lái)中和。由于抗毒素與毒素的結(jié)合具有嚴(yán)格的特異性，因此 E 型肉毒中毒只能用特異性的 E 型肉毒抗毒素來(lái)進(jìn)行治療。由于高品質(zhì)的抗毒素依賴于免疫原性較高的抗原免疫動(dòng)物后獲得的高效價(jià)的免疫血漿，因此，制備高免疫原性的免疫原是提高抗毒素質(zhì)量的前提條件之一。

E 型肉毒梭菌及其毒素具有與其他型別不同的生物特性與多樣性[4-5]，在其生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)毒力值較低的情況，導(dǎo)致免疫動(dòng)物后血漿免疫效價(jià)不理想。為制備具有高免疫原性的 E 型肉毒免疫原，需探索不同方法優(yōu)化其毒素、類毒素的制備過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)加入一定量的胰酶，對(duì)毒素蛋白進(jìn)行激活的方法制備 E 型肉毒毒素，脫毒后免疫動(dòng)物，研究其免疫原性。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 菌種及培養(yǎng)基 實(shí)驗(yàn)用 E 型肉毒梭菌菌種（批號(hào)：WS-E20110901）、多價(jià)肉毒毒素診斷血清和 E 型肉毒梭菌培養(yǎng)基分別由本公司毒素制劑室和培養(yǎng)基室提供。

1.1.2 試劑與儀器 硫酸、甲醛購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；澄清及除菌過(guò)濾濾芯購(gòu)自美國(guó) PALL 公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠（雄性，14 ~ 16 g，批號(hào) 20150323）、豚鼠（雄性，350 g，批號(hào) 20150305）、青紫藍(lán)兔（雌性，2500 g，批號(hào) 2150226）均由本公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供，飼養(yǎng)環(huán)境為 18 ~ 29 ℃，相對(duì)濕度 40%~ 70%。

1.2 方法

1.2.1 E 型肉毒毒素的制備 將 E 型肉毒梭菌菌種復(fù)蘇后，吸取菌液接種于 CM 培養(yǎng)基大管中，30 ℃厭氧培養(yǎng) 48 h。之后將大管的培養(yǎng)液接種于 CM 培養(yǎng)基扁瓶中，輕微振蕩混勻后 30 ℃厭氧培養(yǎng) 24 h。最后將扁瓶培養(yǎng)物接種于含 CM 培養(yǎng)基的大立瓶中進(jìn)行產(chǎn)毒培養(yǎng)，輕微振蕩混勻后 30 ℃培養(yǎng) 5 d。

1.2.2 E 型肉毒毒素的胰酶激活及檢定 胰酶激活 E 型肉毒毒素的主要影響因素為胰酶濃度、激活時(shí)間、pH、溫度等條件。在本實(shí)驗(yàn)中將以上條件的篩選范圍選定為：胰酶濃度 0%、0.25%、0.5%、0.75%、1.0%；激活時(shí)間為 30、45、60、90 min；pH 調(diào)為 5.0、6.0、7.0；溫度為 30、35、37、40 ℃。在以上條件中用 Design Expert 軟件做實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)測(cè)定胰酶激活后毒素毒力，篩選最佳實(shí)驗(yàn)條件。

將培養(yǎng)的 E 型肉毒毒素平均分為 2 份，一份批號(hào)為 201502002-1，另一份用篩選好的條件進(jìn)行胰酶激活，批號(hào)為 201502002-2。

1.2.3 E 型肉毒類毒素的制備及檢定 采用甲醛分段脫毒法，分別將上述兩種方法制備的 E 型肉毒毒素脫毒，制備類毒素。即按原毒素的量首次緩慢加入福爾馬林 0.2%，邊加邊搖勻，封口后置于 37 ℃脫毒7 d。再次加入 0.1% 福爾馬林，37 ℃放置 7 d。根據(jù)國(guó)家藥典要求進(jìn)行結(jié)合力、蛋白氮（PN）、總氮（TN）、pH 測(cè)定、脫毒檢查及毒性逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)[6]。

1.2.4 抗原配制及家兔免疫 根據(jù)類毒素結(jié)合力的檢定結(jié)果，配制免疫用抗原（蛋白含量為2.0 mg/ml）。按常規(guī)免疫程序，分別進(jìn)行基礎(chǔ)免疫和三程超免疫。胰酶激活組與非激活組各程次均注射相同免疫劑量，各程次免疫劑量見(jiàn)表 1。每程次在第 2 針注射后第 20 天采集左右耳緣靜脈血檢測(cè)免疫效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 肉毒毒素型特異性檢查

用多價(jià)肉毒毒素診斷血清，按參考文獻(xiàn)[7]所述方法分別對(duì)上述試驗(yàn)獲得的毒素進(jìn)行型特異性檢查。檢定結(jié)果（表 2）顯示，兩個(gè)批號(hào)的毒素均為 E 型肉毒毒素。

2.2 E 型肉毒毒素的胰酶激活條件篩選

用 Design Expert 軟件對(duì)胰酶激活條件進(jìn)行篩選比對(duì)，結(jié)果顯示 E 型肉毒毒素的胰酶激活條件為胰酶濃度 0.5%、pH 6.0、溫度 37 ℃、激活時(shí)間 45 min 時(shí)效果最佳（篩選過(guò)程實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)略）。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 3。

2.3 E 型肉毒毒素毒力測(cè)定

按參考文獻(xiàn)[7]所述方法分別對(duì) E 型肉毒毒素激活組和未激活組進(jìn)行毒力測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表 4。

2.4 E 型肉毒類毒素的制備及檢定

將兩個(gè)批號(hào)毒素分別加適量甲醛，37 ℃脫毒，制成類毒素。兩組類毒素脫毒檢查和毒性逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)均合格。結(jié)合力、蛋白氮（PN）、總氮（TN）及 pH 測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表 4。

2.5 抗原配制

根據(jù)E 型肉毒類毒素的結(jié)合力進(jìn)行抗原配制，配制抗原結(jié)合力見(jiàn)表 4。

表 1 家兔免疫程序

表 2 肉毒毒素型特異性檢查

表 3 Design Expert 試驗(yàn)結(jié)果

表 4 E 型肉毒毒素未激活組和激活組檢測(cè)結(jié)果

2.6 家兔免疫效價(jià)結(jié)果

按《中國(guó)藥典》規(guī)定方法對(duì)每程采血血樣進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，每個(gè)樣品檢測(cè) 3次，用 SPSS 軟件對(duì)兩個(gè)批號(hào)的 3 個(gè)程次的平均免疫效價(jià)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示值為 0.688（表 4），說(shuō)明胰酶激活組和未激活組的 E 型肉毒毒素制備的抗原免疫家兔后，免疫效價(jià)無(wú)顯著性差異。

3 討論

制備高免疫原性的免疫原來(lái)免疫動(dòng)物，從而獲得高效價(jià)的抗毒素免疫血漿，這對(duì)提高抗毒素產(chǎn)品的抗體效價(jià)與比活性是尤為重要的。因此為了獲得高效價(jià)、高比活性的 E 型肉毒抗毒素，需要生產(chǎn)制備出高免疫原性的 E 型肉毒類毒素。

在本實(shí)驗(yàn)中我們從胰酶濃度（0% ~ 1.0%）、激活時(shí)間（30 ~ 90 min）、pH值（5.0 ~ 7.0）、溫度（30 ~ 40 ℃）這 4 個(gè)試驗(yàn)因素入手，最后選定最佳試驗(yàn)條件為：胰酶濃度 0.5%、激活時(shí)間45 min、pH 6.0、溫度 37 ℃。通過(guò)試驗(yàn)對(duì)比得出，以上條件下胰酶激活制備的 E 型肉毒毒素，毒力顯著上升，增加了 103LD50/ml。

將胰酶激活的 E 型肉毒毒素與常規(guī)方法制備的 E 型肉毒毒素脫毒后免疫動(dòng)物，結(jié)果顯示免疫效價(jià)并未發(fā)生顯著變化，說(shuō)明胰酶激活 E 型肉毒毒素雖可以使毒素毒力大幅度提高，然而并不改變其免疫原性。E 型肉毒梭菌及其毒素具有與其他型別不同的生物特性與多樣性，胰酶使其單鏈蛋白質(zhì)上的賴氨酰鍵被切開(kāi)，產(chǎn)生兩條多肽鏈，為激活的衍生毒素，這種游離的毒性成分使得毒素毒力增強(qiáng)。但類毒素免疫原性的提高還需要在精制提純抗原方面入手，通過(guò)硫酸銨鹽析、酸沉淀法、柱層析法等方法來(lái)進(jìn)行探索。本實(shí)驗(yàn)為 E 型肉毒毒素的相關(guān)研究提供了數(shù)據(jù)支持，建立了技術(shù)平臺(tái)。

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Immunogenicity research of the toxoid prepared from tyrisin activated botulinum toxin type E

DUAN Li-juan, LI Yu-he, XIE Xiao-rong, MENG Xiang-yu, DAI Yu-dong, JIN Xue-min, GAO Jian-jun

Author Affiliation: Lanzhou Institute of Biological Products Co.Ltd., Lanzhou 730046, China

To study and evaluation immunogenicity of the toxoid prepared from tyrisin activated botulinum toxin type E.

Tyrisin were used to activate the toxin of botulinum toxin type E. After detoxified, the rabbits were immuned with the toxoid and immunogenicity were compared with the toxoid prepared from conventional method.

The optimal conditions of trypsin activation were set as follows: 0.5% trypsin concentration, 45 min activation time, pH 6.0, at 37℃. Under these conditions, the toxicity of the tyrisin activated botulinum toxin type E could be increased by 1000times, while the immunogenicity of the toxoid had no significant difference as compared with conventional method.

The toxicity of botulinum toxin type E could be greatly improved through the process of tyrisin activation, but its immunogenicity remains unchanged.

Pancreatin; Toxoids; Immunogenicity; Botulinum toxin type E

GAO Jian-jun, Email: gao5369@163.com

高建軍，Email：gao5369@163.com

2017-09-18

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.01.008