魏 琳，黃明明，曹笑婉，肖 雁，余 暉*

(1.貴州省人民醫(yī)院放射科，貴州 貴陽 550002；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院影像科，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物實驗室，貴州 貴陽 550004)

血管性認知障礙(vascular cognitive impairment, VCI)指由腦血管疾病引起的不同程度認知損害，程度從輕微認知損害至血管性癡呆(vascular dementia, VD)[1-2],嚴重影響老年人的生活質(zhì)量。目前關(guān)于VCI的發(fā)病機制尚未明確，多數(shù)研究[2-3]認為發(fā)生VCI的主要原因包括腦小血管病、多發(fā)腦梗死、關(guān)鍵部位腦梗死、出血/微出血、血管病變、嚴重低灌注、遺傳性血管病變。通常臨床可確診VD時患者大腦神經(jīng)元已發(fā)生嚴重損害，因此早期診斷、干預(yù)VCI可有效緩解疾病進展。目前，有關(guān)VCI的研究多為單中心臨床研究，且各研究結(jié)果存在爭議，VCI患者的異常影像學(xué)指標所對應(yīng)的微觀病理變化尚不清楚。本研究采用MRI、DTI觀察VCI大鼠海馬體積的變化及全腦微觀白質(zhì)的損傷情況，探討診斷早期VCI的影像學(xué)指標。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量200 g，由貴陽醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供[合格證號:SCXK (黔)2012-0001]。DMS2- Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)；Philips Achieva 3.0T X-Series超導(dǎo)MRI掃描儀；5 cm 4通道3.0T小動物射頻線圈(蘇州眾志醫(yī)療科技有限公司)；小動物手術(shù)器械。

1.2 模型建立與行為學(xué)實驗 對30只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后放入水迷宮進行定位航行實驗，從池壁4個起始點的任一點將小鼠面向池壁放入水池，共5天，記錄小鼠找到平臺的時間和游泳路徑；于第6天進行空間探索實驗，撤除原平臺，將大鼠任選1個入水點放入水中，記錄大鼠2 min內(nèi)跨越原平臺的次數(shù)。完成所有訓(xùn)練后將學(xué)習(xí)、記憶能力相近的大鼠隨機分為模型組(n=20)與對照組(n=10)。

對模型組大鼠于建模前12 h停飼、4 h停飲。采用10%水合氯醛進行腹腔注射麻醉(300 mg/kg體質(zhì)量)后，做頸后正中切口，分離第1頸椎兩側(cè)翼孔，電凝雙側(cè)椎動脈后縫合；術(shù)后第2天分離雙側(cè)頸總動脈，血管夾夾閉雙側(cè)頸總動脈30 min，制造大鼠全腦急性缺血性改變。對對照組大鼠重復(fù)以上手術(shù)，但不進行血管處理，即假手術(shù)處理。對建模及假手術(shù)處理造成死亡的大鼠予以剔除，并補足2組相應(yīng)的大鼠數(shù)目。對模型組大鼠分別于術(shù)后2周及1、3、5個月再次進行水迷宮實驗，評估其認知能力變化。

1.3 MR檢查 建?；蚣偈中g(shù)處理后2周及1、3、5個月對2組大鼠均行常規(guī)MRI及DTI掃描。采用10%水合氯醛進行腹腔注射麻醉(300 mg/kg體質(zhì)量)。將大鼠頭部固定于動物專用線圈。常規(guī)T2W序列：FOV 3.5 cm×3.5 cm，矩陣 256×128，層厚1 mm，層間距0，掃描層數(shù)20層，TR 5 800 ms，TE 80 ms。DTI：FOV 3.5 cm×3.5 cm，矩陣256×128，梯度方向數(shù)30，TR 5 000 ms，TE 26 ms，TR 6 000 ms，TE 90 ms，層厚1 mm，層間距0，b=0、800 s/mm2，NEX 4，梯度方向6。

1.4 圖像分析 于T2WI上手動勾畫代表海馬面積的ROI(圖1A)，讀出像素并計算面積，面積=(像素×35×35)/(256×128)mm2，而后利用Matlab 程序計算海馬體積。于DTI圖像分別勾畫海馬位置(圖1B)，選取單片海馬定量描述FA值變化，同時采用FA值分布頻數(shù)圖描述海馬整體FA值變化情況。采用origin 7.0軟件制圖。對所有DTI原始圖像均先行渦流校正，任意選取一只大鼠DTI圖像中b=0的圖像，手動剝離大腦，經(jīng)插片處理后作為配準的參考圖像，采用SPM Coregister進行圖像配準，對配準后的圖像進行3倍于像素的高斯平滑處理，F(xiàn)A 閾值為0.15。

圖1 海馬MR圖像 A.T2WI上海馬體積所取的位置; B.DTI上海馬所取的位置

1.5 病理學(xué)檢查 完成最后的MR掃描后處死大鼠并取出其大腦，以10%甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋并切片，進行HE和尼氏染色，光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料以±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗及重復(fù)測量方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 2組大鼠水迷宮實驗結(jié)果比較(±s)

表1 2組大鼠水迷宮實驗結(jié)果比較(±s)

組別逃避潛伏期(s)空間探索實驗第1次穿越平臺時間(s)穿越平臺次數(shù)(次)模型組(n=20) 術(shù)后2周39．15±9．48?21．37±7．04?2．10±1．12? 術(shù)后1個月46．05±10．88?#26．73±11．08?#1．45±0．89?# 術(shù)后3個月48．31±10．48?#29．03±13．87?#1．35±0．99?# 術(shù)后5個月56．46±6．74?#△＄34．53±11．25?#△1．10±1．07?#△對照組(n=10)16．59±9．088．79±3．814．40±1．78F值49．6712．217．34P值<0．001<0．0010．002 注：?：與對照組比較，P<005；#：與模型組術(shù)后2周比較，P<005；△：與模型組術(shù)后1個月比較，P<005；＄：與模型組術(shù)后3個月比較，P<005

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀測結(jié)果 模型組不同時間點大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力損害隨著術(shù)后時間延長而加重，見表1。與對照組比較，模型組術(shù)后2周、1個月、3個月及5個月大鼠逃避潛伏期明顯延長(P均<0.05)，第1次穿越平臺時間明顯延長(P均<0.05)，穿越平臺次數(shù)明顯減少(P均<0.05)。

2.2 MR T2WI海馬ROI結(jié)果分析 模型組大鼠術(shù)后2周、1個月海馬體積與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；與對照組比較，模型組大鼠術(shù)后3、5個月海馬體積明顯萎縮(P均<0.05)，見圖2。

2.3 DTI基于體素分析方法(voxel-based analysis， VBA)及ROI結(jié)果分析 模型組大鼠術(shù)后2周、1個月海馬區(qū)FA值與對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；與對照組相比，模型組大鼠術(shù)后3、5個月海馬區(qū)FA值明顯減低(P均<0.05)，見圖3。

模型組大鼠術(shù)后2周未見FA值顯著下降的區(qū)域，術(shù)后1個月FA值顯著下降的區(qū)域主要為左側(cè)丘腦、扣帶、右側(cè)島葉、雙側(cè)額葉皮層、紋狀體、胼胝體，術(shù)后3個月FA值顯著下降的區(qū)域主要為雙側(cè)丘腦、雙側(cè)紋狀體、額葉皮質(zhì)、右側(cè)海馬、前連合、胼胝體、島葉、嗅束，術(shù)后5個月FA值顯著下降的區(qū)域主要為雙側(cè)海馬、額葉、頂葉、丘腦、雙側(cè)紋狀體、前聯(lián)合、胼胝體和扣帶，見圖4～7。

圖2 2組大鼠術(shù)后不同時間點海馬體積比較 (*：與對照組比較，P<0.05)

圖3 2組大鼠術(shù)后不同時間點海馬區(qū)FA值比較 (*：與對照組比較，P<0.05)

2.4 VCI大鼠腦海馬區(qū)病理學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示模型組大鼠海馬區(qū)錐體細胞排列紊亂，數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)模糊，神經(jīng)元出現(xiàn)核固縮，空泡化明顯(圖8A);尼氏染色結(jié)果顯示模型組海馬神經(jīng)元細胞水腫，空泡變性，細胞胞漿內(nèi)尼氏體顏色淺淡、輪廓模糊，數(shù)目減少，部分細胞內(nèi)尼氏體溶解、消失(圖8B)。

3 討論

研究[4-6]顯示，大腦長期慢性低灌注可導(dǎo)致動物發(fā)生認知功能障礙、皮層下白質(zhì)損害、海馬神經(jīng)元損傷及腦小血管病變等，因此動物大腦長期反復(fù)慢性低灌注模型是復(fù)制VCI的較理想動物模型。本實驗采用的改良四血管法是國際公認的VCI建模方法之一，其制作過程與VCI的發(fā)病機制接近，小血管病變明顯，建模后病理變化及海馬損傷顯著[4-6]。Deng-Bryant等[7]研究顯示，Morris水迷宮實驗可用于檢測大鼠的認知能力。本實驗通過Morris水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比模型組大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力明顯降低，表明建模成功；且模型組術(shù)后2周、1個月、3個月、5個月大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力隨著術(shù)后時間的延長而損害加重，提示此模型誘導(dǎo)產(chǎn)生了慢性持續(xù)性缺血性改變。

圖4 模型組大鼠術(shù)后2周基于體素的FA值分析圖 未見FA值顯著下降的區(qū)域

圖5 模型組大鼠術(shù)后1個月基于體素的FA值分析圖 FA值顯著下降的區(qū)域主要為左側(cè)丘腦、扣帶、右側(cè)島葉、雙側(cè)額葉皮層、紋狀體、胼胝體

圖6 模型組大鼠術(shù)后3個月基于體素的FA值分析圖 FA值顯著下降的區(qū)域主要為雙側(cè)丘腦、雙側(cè)紋狀體、額葉皮質(zhì)、右側(cè)海馬、前連合、胼胝體、島葉、嗅束

圖7 模型組大鼠術(shù)后5個月基于體素的FA值分析圖 FA值顯著下降的區(qū)域主要為雙側(cè)海馬、額葉、頂葉、丘腦、雙側(cè)紋狀體、前聯(lián)合、胼胝體和扣帶

圖8 模型組大鼠海馬區(qū)病理變化 A.HE染色(×200)； B.尼氏染色(×200)

VCI患者常伴不同程度的皮質(zhì)萎縮，以顳葉海馬萎縮為著[8-9]。動物實驗[10]也顯示VCI動物模型存在明顯海馬損傷，并導(dǎo)致認知能力受損，且認知能力下降程度與海馬組織受損傷的體積有關(guān)。因此，本研究將海馬作為ROI進行研究。本研究顯示，與對照組比較，模型組大鼠3、5個月海馬體積明顯萎縮且海馬區(qū)FA值明顯減低(P均<0.05)，提示海馬體積的減小與白質(zhì)的損傷有關(guān)；且隨著時間的延長，海馬組織損傷越重，認知能力下降越明顯。本研究觀察海馬區(qū)病理組織學(xué)的變化，可見海馬區(qū)錐體細胞排列紊亂、結(jié)構(gòu)模糊，尼氏小體溶解、消失，與DTI顯示FA值下降相符，進一步證實認知能力下降與海馬區(qū)神經(jīng)元損傷有關(guān)。

Soria等[11]通過動物研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組動物梨狀體、額葉、島葉皮質(zhì)區(qū)、海馬、丘腦、紋狀體和視神經(jīng)道等FA值顯著減少，相應(yīng)學(xué)習(xí)與記憶功能顯示受損。Choi等[12]通過DTI分析發(fā)現(xiàn)VCI患者認知能力下降，白質(zhì)的超微結(jié)構(gòu)損害逐步加重。本研究中，術(shù)后1個月模型組大鼠大腦即出現(xiàn)多部位FA值下降且FA值下降早于海馬體積變化，提示FA值下降更有助于評估早期VD；術(shù)后1個月額葉FA值下降提示額葉微觀白質(zhì)發(fā)生了損害。研究[12]表明額葉-皮質(zhì)下環(huán)路與VCI認知及執(zhí)行功能有關(guān)，這一環(huán)路纖維發(fā)生破壞會導(dǎo)致認知及執(zhí)行功能障礙。Fu等[13]研究發(fā)現(xiàn)VCI患者胼胝體FA值較對照組顯著下降，胼胝體損害可導(dǎo)致記憶力和人格異常改變。本研究中模型組大鼠術(shù)后1、3、5個月VBA均可顯示胼胝體損傷?？蹘べ|(zhì)是執(zhí)行功能神經(jīng)中樞的高級調(diào)控結(jié)構(gòu)，其纖維損傷也可影響認知能力，本研究也發(fā)現(xiàn)模型組大鼠扣帶損傷。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)模型組大鼠模型丘腦、紋狀體區(qū)域FA值下降，且隨著時間延長，范圍逐漸擴大，提示丘腦與紋狀體損傷可能與認知能力的下降有關(guān)。

本研究的局限性為對VCI大鼠僅進行MRI與DTI掃描。多種功能MRI如磁共振波譜、磁敏感加權(quán)成像、動脈自旋標記等可從不同角度對疾病進行研究，對理解疾病的發(fā)病機制有幫助，還有待進一步補充。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，T2WI和DTI觀察大鼠海馬體積以及微觀白質(zhì)變化，有助于早期診斷VCI。全腦VBA分析可發(fā)現(xiàn)VCI大鼠腦內(nèi)多個區(qū)域FA值下降，且隨認知障礙程度加重，損傷范圍逐漸擴大，其中額葉、丘腦、胼胝體、紋狀體、扣帶等區(qū)域與認知能力下降有關(guān)；FA值下降早于海馬體積變化，提示FA值可作為早期診斷VCI及評估嚴重程度的觀察指標。

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三線表的規(guī)范格式

▲表序和表題：表序即表格的序號，一篇論文中如只有1個表格，則表序編為表1，表題即表格的名稱，應(yīng)準確得體并能確切反映表格的特定內(nèi)容且簡短精練。

▲項目欄：指表格頂線與欄目線之間的部分，欄目是該欄的名稱，反映了表身中該欄信息的特征或?qū)傩浴?/p>

▲表身：三線表內(nèi)底線以上，欄目線以下的部分叫做表身，是表格的主體表身內(nèi)的數(shù)字一般不帶單位，百分數(shù)也不帶百分號，均歸并在欄目中表身中不應(yīng)有空項，如確系無數(shù)字的欄，應(yīng)區(qū)別情況對待，在表注中簡要說明，不能輕易寫“0”或畫“-”線等填空，因“-”可代表陰性反應(yīng)，“0”代表實測結(jié)果為零。

▲表注：必要時，應(yīng)將表中的符號標記代碼，以及需要說明的事項，以最簡練的文字，橫排于表題下作為表注也可附注于表下。