張 英，滕 嬌，汪 月，鄧麗娜，楊奕娜

(1深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院,廣東深圳518102；2深圳愛生再生醫(yī)學(xué)科技有限公司,廣東 深圳518118)

0 引言

在年輕女性中,宮頸癌發(fā)病率排名第二,嚴(yán)重威脅女性的健康［1］。人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是宮頸癌的主要致病因子。有研究報道,約90%的宮頸癌是由 HPV持續(xù)性感染導(dǎo)致的［2］。根據(jù)其致癌性,HPV可分為低危型和高危型兩種,其中高危型病毒主要包括HPV16和HPV18等,約 60%的宮頸癌與 HPV16 感染相關(guān)［3－4］。

現(xiàn)在可以通過接種疫苗來預(yù)防HPV持續(xù)感染和宮頸癌的發(fā)生［5－7］。但是預(yù)防性HPV疫苗不能清除已經(jīng)發(fā)生的HPV感染,或治療HPV陽性的宮頸癌。在國內(nèi)治療宮頸癌臨床上經(jīng)常采用干擾素等改善全身或局部免疫功能,而不是直接針對病毒本身,無法有效清除HPV病毒,其治療效果存在爭議。因此,我們迫切需要開發(fā)治療HPV感染和宮頸癌的有效手段。

近年來,隨著腫瘤免疫學(xué)等新興學(xué)科和技術(shù)的迅速發(fā)展,腫瘤免疫療法取得重大突破,成為繼傳統(tǒng)手術(shù)、化療和放療之后新的腫瘤治療手段。腫瘤免疫療法的重要代表之一,嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞(chimeric antigen receptor T cells,CAR-T),在治療血液腫瘤中獲得突出的療效［8－11］。 2017年,美國 FDA批準(zhǔn)了兩款靶向CD19抗原的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品Kymriah和Yescarta上市,為治愈難治復(fù)發(fā)性B細(xì)胞前體急性淋巴性白血病或大B細(xì)胞淋巴瘤帶來希望。與此同時,開發(fā)治療實(shí)體瘤的CAR-T細(xì)胞日益受到重視,也面臨多方面的挑戰(zhàn),如難以找到合適的靶標(biāo)抗原［12－15］。 HPV 的 E6和 E7 蛋白是高危型 HPV 的主要致癌蛋白,其通過影響細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等方面使宿主細(xì)胞永生化而致瘤。E7蛋白只在HPV感染的細(xì)胞、大多數(shù)HPV陽性宮頸癌細(xì)胞和癌前病變組織中持續(xù)表達(dá),而在正常組織中不表達(dá),因此其可以成為宮頸癌CAR-T細(xì)胞治療的理想靶點(diǎn)。在宮頸癌細(xì)胞中,部分E7蛋白可被蛋白酶體切割成短肽片段,由人類白細(xì)胞抗原((human lymphocyte antigen,HLA)呈遞在細(xì)胞表面,其形成的抗原肽-MHC復(fù)合物,可以被T細(xì)胞識別和攻擊。根據(jù)已有的研究報道,本實(shí)驗(yàn)設(shè)計和制備靶向 HPV16 E711-19：HLA-A*0201復(fù)合物的CAR-T細(xì)胞,并在體外成功驗(yàn)證其殺傷HPV16陽性的Ca Ski細(xì)胞株的能力,為開發(fā)CAR-T細(xì)胞治療宮頸癌提供了初步的研究支持。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 293T、Ca Ski和HeLa細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室原有保存樣品。X-Vivo 15培養(yǎng)基(Lonza,04-418Q)、RPMI-1640(Gibco,11875093)、DMEM(Gibco,11995065)、胎牛血清(達(dá)科為,6021011)、青霉素-鏈霉素溶液(碧云天,C0222)、胰蛋白酶(Gibco,25200056)、淋巴細(xì)胞分離液(Stem Cell,18051)、無菌生理鹽水(四川科倫藥業(yè),H51021158),細(xì)胞凍存液(達(dá)科為,DKW36-CFM0100)、Dynabeads?Human T-Expander CD3/CD28(Thermo,11141D)、白細(xì)胞介素-2(peprotech,200-02-10)、白細(xì)胞介素-7(peprotech,200-07-10)、白細(xì)胞介素-15(peprotech,200-15-10)、branched polyethylenimine(Sigma,408727-100ML)、polybrene(SantaCruz,sc-134220)、Genomic DNA Purification Kit(Lifetech,K0512)、Maxi prep 質(zhì)粒提取試劑盒(Qiagen,12262)、EGFRt mAb(Lilly,Cetuximab)、anti-human IgG Fc antibody-PE(Biolegend,409303)、anti-human CD4-FITC(Biolegend,300505)、mouse IgG1,κ isotype ctrl-FITC(Biolegend,400109)、anti-human CD8 -Cy5.5(Biolegend,344709)、mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody-Cy5.5(Biolegend,400149)、Cell Counting Kit-8(東仁化學(xué),CK04)、人 IFN-γ ELISA檢測試劑盒(聯(lián)科生物,70-EK1801)、人白細(xì)胞介素-2高靈敏ELISA試劑盒(聯(lián)科生物,70-EK102HS-48)。

1.2 方法

1.2.1 合成靶向HPV16 E7：HLA的CAR基因 在特異性識別HPV16 E711-19：HLA-A*0201復(fù)合物單抗的基礎(chǔ)上,設(shè)計第三代CAR。CAR的胞外部分為CD8α前導(dǎo)肽、scFv序列和CD8α鉸鏈區(qū),采用CD28的跨膜區(qū)和胞內(nèi)激活域,4-1BB胞內(nèi)激活域,以及CD3ζ片段。CAR通過“自切割”的多肽序列T2A與截短的EGFR(EGFRt)連接,用于CAR的表達(dá)檢測。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計的CAR結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 CAR的組成元件示意圖

1.2.2 構(gòu)建HPV16 E7：HLA CAR慢病毒表達(dá)載體根據(jù)CAR的氨基酸序列,設(shè)計相應(yīng)的基因序列,并對密碼子進(jìn)行優(yōu)化。合成CAR的基因序列,將其連接到經(jīng)Xba I和Sal I酶切的慢病毒表達(dá)載體pCDHEF1α-MCS-T2A-Puro中。酶切鑒定目的基因片段,并進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證。采用Qiagen Maxi prep試劑盒提取無內(nèi)毒素的 pCDH-EF1α-HPV16 E7：HLA CAR-EGFRt、psPAX2和pMD2.G質(zhì)粒。

1.2.3 包裝HPV16 E7：HLA CAR慢病毒 將293T細(xì)胞傳代至10 cm培養(yǎng)皿,置于培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%,更換新鮮的無血清DMEM培養(yǎng)基。 分別取 8 μg 的 HPV16 E7：HLA CAR、psPAX2和 pMD2.G 質(zhì)粒,溶于 480 μL 1×HBS(pH 7.4)。 將100 μmol/L PEI儲存液用1×HBS 稀釋至10 μmol/L,取360 μL PEI溶液滴加至質(zhì)粒溶液,邊加邊混勻,室溫靜置20 min。將DNA-PEI混合物滴加到細(xì)胞培養(yǎng)皿中,置培養(yǎng)箱8 h,更換為含血清的完全培養(yǎng)基。48 h后,收集含病毒顆粒的培養(yǎng)基上清,4℃,500×g離心10 min。將離心獲得的上清用0.45 μm的濾膜過濾,將濾液轉(zhuǎn)至無菌離心管中,配平后,4℃,50 000×g離心2 h。離心結(jié)束后,小心將離心管中的液體吸去,加入1 mL PBS重懸病毒沉淀,置于－80℃保存。

1.2.4 T細(xì)胞的分離和激活 將抗凝處理的人外周血樣品轉(zhuǎn)移至一個15 mL無菌離心管內(nèi),800×g離心20 min。吸去血清層,然后向下層的外周血細(xì)胞層加入等體積的生理鹽水,輕輕上下顛倒混勻。取一根15 mL離心管,加入5 mL淋巴細(xì)胞分離液。使用移液器小心將稀釋的血樣沿管壁緩慢加至淋巴細(xì)胞分離試劑的上層,避免分離試劑與血樣的混合,800×g離心20 min。將處于中間的白色單核細(xì)胞層吸至一個新的無菌離心管中,加入等體積的生理鹽水輕輕混勻,800×g離心5 min,去除上清。重復(fù)清洗一次PBMC,調(diào)整細(xì)胞密度至5×107/mL,轉(zhuǎn)移至2 mL細(xì)胞凍存管。用PBS將Dynabeads洗滌2遍,取適量的Dynabeads加入到 PBMC中,輕輕混勻,室溫孵育20 min。將2 mL細(xì)胞凍存管插入磁極,室溫靜置1 min,然后輕輕倒置,將管內(nèi)的液體倒出。將細(xì)胞凍存管從磁極中取出,加入3 mL X-Vivo 15培養(yǎng)基(含200 IU/mL IL-2,10 ng/mL IL-7,5 ng/mL IL-15和5 ng/mL IL-21),重懸細(xì)胞和beads混合物,并調(diào)整細(xì)胞密度至0.5－1×106/mL。將細(xì)胞置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)48 h后,將細(xì)胞密度調(diào)整至1×106/mL。

1.2.5 制備 HPV16 E7：HLA CAR-T細(xì)胞 按照MOI＝20,計算所需要的病毒量。計算公式：所需病毒量(mL)＝(MOI*細(xì)胞數(shù)量)/病毒滴度。從－80℃超低溫冰箱中,取出慢病毒,迅速在37℃水浴鍋中解凍。向培養(yǎng)的T細(xì)胞中加入polybrene至終濃度為6 μg/mL和上述計算所得的病毒量,用移液器輕輕混勻,室溫800×g離心1 h。將培養(yǎng)器皿置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中,24 h后,更換培養(yǎng)基。每天輕輕吹打beads/細(xì)胞團(tuán)至完全分開,并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度至0.5－1×106/mL。第8天通過FACS檢測細(xì)胞EGFRt的表達(dá)(指示CAR-T細(xì)胞的陽性率),并檢測CD4+T、CD8+T細(xì)胞的比例。離心收集制備的CAR-T,進(jìn)行分裝和凍存。

1.2.6 CCK-8法檢測HPV16 E7：HLA CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒性 采用細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒檢測HPV16 E7：HLA CAR-T細(xì)胞對 Ca Ski和 HeLa細(xì)胞的殺傷效果。取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔接種1×104個Ca Ski或 HeLa細(xì)胞(100 μL DMEM 培養(yǎng)基),在37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。向各孔分別加入1×104、5×104、10×104和 20×104個 HPV16 E7：HLA CAR-T細(xì)胞(100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基),對照組不接種CAR-T細(xì)胞,每組3個平行孔。共培養(yǎng)4 h。吸取培養(yǎng)基上清,PBS洗滌培養(yǎng)板孔中細(xì)胞兩次,去除殘留的CAR-T細(xì)胞后用于細(xì)胞因子檢測。在原孔加入 100 μL DMEM 培養(yǎng)基,加入 10 μL CCK-8 溶液,置37℃,5%CO2共孵育2 h。用酶標(biāo)儀測定OD 450 nm。

細(xì)胞活力＝［(As-Ab)/(Ac-Ab)］×100%。 As實(shí)驗(yàn)孔(含有癌細(xì)胞的培養(yǎng)孔、加入CAR-T細(xì)胞,加CCK-8)；Ac對照孔(含有癌細(xì)胞的培養(yǎng)孔、不加CAR-T細(xì)胞,加CCK-8)；Ab空白孔(不含癌細(xì)胞和CAR-T細(xì)胞的培養(yǎng)孔、加培養(yǎng)基、加CCK-8)。

1.2.7 ELISA檢測IFN-γ和IL-2水平 將上述實(shí)驗(yàn)中 HPV16 E7：HLA CAR-T 細(xì)胞對與 Ca Ski、HeLa細(xì)胞(HPV16 E7：HLA CAR-T 細(xì)胞與 Ca Ski、HeLa細(xì)胞濃度比例分別都是10∶1)共孵育4 h后收集的培養(yǎng)基上清,12 000 rpm離心5 min,吸取上清。按照人IFN-γ ELISA或人白細(xì)胞介素-2高靈敏檢測試劑盒說明書,進(jìn)行細(xì)胞因子檢測實(shí)驗(yàn)。檢測結(jié)果用Graph-Pad Prism 7軟件計算x±s。

2 結(jié)果

2.1 CAR慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建 利用XbaI和SalI酶將克隆的HPV16 E7：HLA CAR表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行酶切和瓊脂糖凝膠電泳,可以觀察到被切割的目的片段在1500 bp和2000 bp之間,與預(yù)期的片段大小一致,表明CAR和EGFRt序列成功連接到表達(dá)質(zhì)粒中。

圖2 HPV16 E7：HLA CAR表達(dá)質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳

2.2 HPV16 E7：HLA CAR-T細(xì)胞構(gòu)建及鑒定

FACS分析EGFRt的表達(dá)：紅色和藍(lán)色部分分別為T細(xì)胞對照組、HPV16 E7：HLA CAR-T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組利用EGFRt抗體進(jìn)行免疫熒光染色后的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果。CAR-T細(xì)胞EGFRt表達(dá)率為41.2%,即T細(xì)胞的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

圖3 FACS檢測EGFRt的表達(dá)水平

CAR-T細(xì)胞亞群檢查：紅色部分為陰性對照組,藍(lán)色部分為HPV16 E7：HLA CAR-T細(xì)胞利用 CD4或CD8抗體進(jìn)行免疫熒光染色后的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果：(A)CD4+的CAR-T細(xì)胞為85.2%,(B)CD8+的CAR-T細(xì)胞為30.9%。

圖4 FACS分析CD4+以及CD8+的細(xì)胞亞群比例

2.3 HPV16 E7：HLA CAR-T細(xì)胞體外對Ca Ski細(xì)胞殺傷作用橫坐標(biāo)是HPV16 E7：HLA CAR-T細(xì)胞數(shù),縱坐標(biāo)是靶細(xì)胞活力。從圖中可以看出,HPV16 E7：HLA CAR-T細(xì)胞數(shù)量與對Ca Ski細(xì)胞的殺傷效果成正比。CAR-T細(xì)胞與Ca Ski細(xì)胞數(shù)比值是1∶1、5∶1、10∶1、20∶1時對應(yīng)的 Ca Ski細(xì)胞活力為97.2%、83.2%、56.8%、24.8%,而對HeLa細(xì)胞的殺傷作用較小,CAR-T細(xì)胞與HeLa細(xì)胞數(shù)比值是1∶1、5∶1、10∶1、20∶1時對應(yīng)的HeLa細(xì)胞活力為95.1%、103.7%、98.3%、50.7%。 HPV16 E7：HLA CAR-T細(xì)胞對Hela細(xì)胞的殺傷是在其10倍細(xì)胞濃度之前包括10倍情況下無殺傷,20倍細(xì)胞濃度的情況下才有較強(qiáng)的殺傷效果。

2.4 ELISA檢測IFN-γ、IL-2的分泌水平 HPV16 E7：HLA CAR-T 細(xì)胞與 Ca Ski、HeLa 細(xì)胞濃度比例分別都是10：1時經(jīng)人IFN-γ ELISA檢測試劑盒檢測,殺傷Ca Ski細(xì)胞上清的IFN-γ的濃度是100.213±8.037 pg/mL,殺傷HeLa細(xì)胞上清的IFN-γ的濃度是16.111±3.181 pg/mL。經(jīng)人白細(xì)胞介素2高敏ELISA試劑盒檢測殺傷Ca Ski細(xì)胞上清的IL-2的濃度是24.313±3.710 pg/mL,殺傷HeLa細(xì)胞上清的IL-2的濃度是6.472±3.489 pg/mL。IFN-γ和白細(xì)胞介素2具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤的作用,試驗(yàn)結(jié)果測的細(xì)胞因子濃度和殺傷試驗(yàn)效果結(jié)果相符合,即殺傷效果越明顯,相應(yīng)的細(xì)胞因子就越多。

3 討論

在女性所患癌癥中,宮頸癌的發(fā)病率較高,目前主要治療手段有手術(shù)、放療、化療、靶向藥物治療等。此外,宮頸癌可以通過接種HPV疫苗來預(yù)防。隨著對宮頸癌認(rèn)識的深入和醫(yī)療技術(shù)的提高,提高患者術(shù)后生活質(zhì)量,但是手術(shù)治療不能應(yīng)對已發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者。放療容易對患者的卵巢功能造成損傷,大多用于晚期宮頸癌患者。化療毒性大,腫瘤容易產(chǎn)生耐藥性。因此,我們希望能夠開發(fā)出一種比較安全高效的治療手段。腫瘤免疫療法在2013年被《Science》雜志評為年度十大科技突破之首,顯示的強(qiáng)大的抗腫瘤效果。CAR-T細(xì)胞技術(shù)作為腫瘤免疫療法的重要代表之一,可以用于開發(fā)治療宮頸癌的新技術(shù)。

與靶向腫瘤細(xì)胞表面蛋白制備的CAR-T細(xì)胞相比,靶向抗原肽-MHC復(fù)合物的CAR-T細(xì)胞特異性高,脫靶毒性小。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計和構(gòu)建了針對抗原肽-MHC復(fù)合物的HPV16 E7：HLA CAR-T細(xì)胞,并開展了相關(guān)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),對體外殺傷實(shí)體瘤細(xì)胞進(jìn)行了初步的探索。本實(shí)驗(yàn)證明了制備HPV16 E7：HLA CAR-T細(xì)胞是可行的,且具有較高的細(xì)胞毒性。在體外殺傷試驗(yàn)中,對非靶細(xì)胞在20倍細(xì)胞濃度的情況下也有殺傷,分析可能是因?yàn)殡S著細(xì)胞數(shù)量的增大,CAR-T細(xì)胞表面的的其他T細(xì)胞抗原受體和癌細(xì)胞結(jié)合,非靶向抗原肽-MHC復(fù)合物的殺傷。本實(shí)驗(yàn)主要進(jìn)行了CAR-T細(xì)胞構(gòu)建和初步的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示對靶細(xì)胞Ca Ski具有明顯的殺傷效果,為動物試驗(yàn)和后續(xù)深入研究奠定了初步的研究基礎(chǔ)。