楊敏 楊立軒 韋妮 馮潔 郭子鵬 凌秀孟 莫庸 韋金花 王俐 謝尤祥 馮雪萍

【摘要】?目的?探討紅薯葉總黃酮對小鼠急性腦缺血缺氧的作用。方法?制備紅薯葉總黃酮溶液，通過飽和MgCl2致小鼠急性腦缺血實驗、NaNO2中毒性缺氧實驗、常壓耐缺氧實驗和小鼠斷頭實驗，檢測急性腦缺血缺氧小鼠腦組織中總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性和丙二醛 （MDA）含量變化。結(jié)果?與正常對照組比較，各給藥組小鼠的存活時間均延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或0.01）;各給藥組腦指數(shù)和MDA含量均下降，T-SOD活性提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論?紅薯葉總黃酮溶液對腦缺血缺氧損傷有一定的保護作用。

【關(guān)鍵詞】?紅薯葉總黃酮;腦缺血缺氧;小鼠;保護作用

中圖分類號：R285.5?文獻標(biāo)識碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.06.002

紅薯味甘，性平，具有補中、益氣、健脾、通便等多種功效，是我國主要農(nóng)作物之一?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明紅薯莖、葉中富含各種化學(xué)成分，其提取物具有廣泛的醫(yī)療和保健作用。目前，對紅薯葉的研究主要集中在其提取物黃酮化合物及其功能、活性多糖及其功能和紅薯葉作為保健食品的開發(fā)利用等方面。研究證實，紅薯葉黃酮化合物具有抗癌、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、治療骨質(zhì)疏松、抗菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗輻射、治療腹瀉等多重作用[1]?！八幨惩础笔侵嗅t(yī)推崇的疾病防治方法，經(jīng)常食用紅薯葉有美容護膚，延年益壽的功效，在歐美、日本等國家及香港地區(qū)掀起一股“紅薯葉熱”，而在國內(nèi)大部分地區(qū)紅薯葉卻被廢棄或作為動物飼料，沒有得到充分的利用。因此，對紅薯葉進行開發(fā)利用具有廣闊的市場前景[2]。目前為止尚未發(fā)現(xiàn)紅薯葉總黃酮對缺血性腦血管疾病的相關(guān)研究，本實驗通過構(gòu)建四個經(jīng)典小鼠急性腦缺血缺氧模型，觀察紅薯葉總黃酮對腦缺血缺氧的保護作用，并初步探討其可能的作用機制，為紅薯葉的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?實驗材料

1.1.1?儀器

KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器、電熱恒溫水浴鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、FSH-2A可調(diào)高速電動勻漿機、高速臺式離心機、722型分光光度計、FA（N）/JA（N）電子天平。

1.1.2?動物

SPF級昆明小鼠120只[由右江民族醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，許可證號：SCXK（桂）2017-2003，使用許可證號：SYXK（桂）2017-0004]，雄雌各半，體重（20±2）g。小鼠在正式實驗前均在SPF級實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，自由采食和飲水。

1.1.3?藥品

紅薯葉（采摘于廣西百色市）;尼莫地平片（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號：B160309015）;乙醇（分析純，生產(chǎn)批號：20170115，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）;鈉石灰（生產(chǎn)批號：20170210，上海納輝干燥試劑廠）;總超氧化物歧化酶（T-SOD）測定試劑盒（生產(chǎn)批號：20170809）、丙二醛 （MDA）測定試劑盒（生產(chǎn)批號：20170806）和總蛋白測定試劑盒（生產(chǎn)批號：20170809），均購自南京建成生物工程研究所。

1.2?實驗方法

1.2.1?紅薯葉總黃酮的制備

（1）提?。翰杉迈r的紅薯葉去雜、清水漂洗并瀝干其表面水分，（80±1）℃鼓風(fēng)干燥72 h以上，冷卻后粉碎，過40目篩后，置干燥器備用。精密稱取紅薯葉粉末200 g，加2000 mL 70%乙醇，密閉浸泡過夜，超聲波提取2.5 h，抽濾。濾渣再加1500 mL 70%乙醇，超聲波提取1.5 h，抽濾，合并兩次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，然后用乙酸乙酯萃取3次，真空干燥，得到紅薯葉粗制總黃酮粉末。（2）純化：將提取得到的粗黃酮化合物在AB8大孔樹脂柱上進行純化，用500 mL 60%乙醇洗脫，收集乙醇部分，減壓濃縮，在冷凍機中干燥得到純化黃酮。（3）鑒定：將純化后得到的總黃酮取少量溶于1 mL甲醇溶液試管中，加入濃鹽酸2～3滴，再加少量鎂粉，觀察到玫瑰紅色即可確定為紅薯葉總黃酮。（4）含量的測定：采用以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品的比色法測定總黃酮含量。

1.2.2?小鼠急性腦缺血實驗[3]

1.2.2.1?飽和MgCl2致小鼠急性腦缺血實驗

SPF級昆明小鼠30只，雌雄各半，體重（20±2）g，隨機分成三組：空白組、總黃酮提取組、尼莫地平組;每天灌胃，紅薯葉總黃酮提取組和尼莫地平組的給藥劑量分別為200 mg·kg-1、18 mg·kg-1，空白組用等量生理鹽水灌胃，連續(xù)7天，末次給藥1 h后，小鼠尾靜脈注射飽和MgCl2溶液（0.1 mL·10 g-1），記錄存活時間為從注射藥品至最后一次張口喘息的時間。

1.2.2.2?4%NaNO2溶液腹腔注射所致小鼠中毒性缺氧實驗

SPF級昆明小鼠30只，雌雄各半，體重（20±2）g，分組及給藥方法同1.2.2.1，NaNO2給藥劑量為（0.1 mL·10 g-1）

1.2.2.3?常壓耐缺氧實驗

SPF級昆明小鼠30只，雌雄各半，體重（20±2）g，分組及給藥方法同1.2.2.1，末次給藥1 h后，將小鼠放入裝有20 g鈉石灰的150 mL的帶塞的廣口瓶中，記錄小鼠從放入瓶中至停止呼吸的時間。

1.2.2.4?小鼠斷頭實驗

SPF級昆明小鼠30只，雌雄各半，體重（20±2）g，分組與操作方法同1.2.2.1，末次給藥前稱重，給藥后1 h，迅速從小鼠耳后頸部斷頭，記錄小鼠張口喘息次數(shù)和喘息維持的時間，然后冰上取全腦，計算腦指數(shù)。再用9倍4 ℃生理鹽水將腦組織勻漿，制成10%勻漿液，離心取上清4 ℃保持備用。

1.2.3?小鼠腦組織中T-SOD和MDA的含量測定

取制備好的腦組織勻漿，參照試劑盒說明書進行操作。

1.3?統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，運用單因素方差分析（LSD 法）進行組間比較，檢驗水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2?結(jié)果

2.1?總黃酮的含量測定

2.1.1?標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，溶于100 mL 60%乙醇，分別精密吸取蘆丁對照液（0.10 mg·mL-1）0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于10.00 mL容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min;再加10%硝酸鋁溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min;再加4%氫氧化鈉溶液4.00 mL，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置12 min，以試劑作空白參比液，于510 nm處測吸光度[4]。以蘆丁濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蘆丁溶液濃度（Y）與吸光度值（A）關(guān)系曲線的回歸方程式：Y=0.1468X+0.0019，絕對系數(shù) R2=0.999。

2.1.2?樣品含量的測定

精密稱取樣品總黃酮10 mg，溶于100 mL 60%乙醇，吸取樣品液1 mL，置10 mL容量瓶，60%乙醇補足至刻度，測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算樣品中總黃酮的含量為0.5 mg/mL。

2.2?紅薯葉總黃酮對3種模型小鼠耐缺氧存活時間的影響

由表1可知，與正常對照組相比，尼莫地平組和總黃酮提取組均能延長飽和MgCl2致小鼠急性腦缺血的存活時間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），也能延長NaNO2所致小鼠中毒性缺氧的存活時間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;兩個給藥組均能顯著延長小鼠常壓耐缺氧的存活時間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或0.01）;尼莫地平組與總黃酮提取組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.3?紅薯葉總黃酮對小鼠斷頭喘息的影響

由表2可知，與正常對照組比較，各給藥組均能增加小鼠斷頭后的喘息次數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），延長小鼠斷頭后的喘息維持時間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;尼莫地平組與總黃酮提取組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.4?紅薯葉總黃酮對急性全腦缺血缺氧小鼠腦指數(shù)及T-SOD和MDA含量的影響

由表3可知，與正常對照組比較，各給藥組腦指數(shù)和MDA含量均顯著下降，SOD活性顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;尼莫地平組與總黃酮提取組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3?討論

缺血性腦血管病是危害人類健康的疾病，具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率的特點[5]，發(fā)病機制復(fù)雜，難治愈，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。在腦組織發(fā)生缺血和缺氧的情況下，腦細(xì)胞會釋放大量的炎癥因子、興奮性氨基酸參與組織損傷過程，從而誘發(fā)腦功能障礙疾病[6]。腦缺血缺氧是一個復(fù)雜的病理過程，需及時進行治療，否則會導(dǎo)致腦損傷加重甚至死亡。目前治療缺血性腦損傷，主要是從抗谷氨酸受體、抗鈣超載、抗自由基這些途徑入手，至今尚無有效的治療方法[7]。腦缺血缺氧損傷是一個復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，其損傷機制主要與自由基生成增多等因素有關(guān)[8]。已證實紅薯葉黃酮類化合物是一種很好的自由基清除劑[9]，可以提高老齡糖尿病大鼠的免疫力[10];改善模型動物體重，顯著降低內(nèi)臟脂肪含量和空腹血漿胰島素水平，對非胰島素依賴型糖尿病小鼠具有降低血糖、血脂和增加抗氧化性的功能[11]，還可以改善糖尿病小鼠腎臟的損傷，對腎細(xì)胞具有良好的保護作用[12]。

當(dāng)腦組織由于各種原因?qū)е氯毖毖鯐r，就會產(chǎn)生大量炎癥因子，引起腦水腫，進而弱化血腦屏障功能，加速炎癥因子進入腦組織，加劇對腦部的損傷[13]。本實驗通過幾個經(jīng)典小鼠腦缺血模型檢測紅薯葉總黃酮對腦的保護作用，結(jié)果提示：紅薯葉總黃酮可顯著延長飽和MgCl2所致急性腦缺血小鼠和NaNO2所致小鼠中毒性缺氧的存活時間，增加斷頭小鼠喘息次數(shù)，延長斷頭小鼠喘息時間，降低小鼠腦指數(shù)和MDA含量，提高T-SOD活性。實驗結(jié)果說明紅薯葉總黃酮對模型小鼠腦缺血后的功能具有一定的維持作用，能顯著提高模型小鼠腦組織中T-SOD的活性，降低MDA的含量，并能緩解由于腦組織在急性缺血缺氧的情況下造成的腦組織水腫。各實驗組均以尼莫地平作為陽性對照藥，結(jié)果表明尼莫地平能起到顯著緩解腦缺血缺氧的作用，驗證了其治療缺血性腦血管病的藥效。兩個給藥組相比較，紅薯葉總黃酮幾乎具備與尼莫地平同樣的抗腦缺血缺氧的藥效，因此可以推測長期食用紅薯葉可以達到預(yù)防腦血管疾病的目的。

總之，從實驗可以看出紅薯葉總黃酮具有很強的抗氧化性，可以減輕氧化應(yīng)激對腦組織造成的損傷，對腦組織具有一定的保護作用，其保護機制可能與黃酮化合物具有直接清除氧自由基活性有關(guān)。另外，紅薯葉黃酮還是天然食品的提取物兼具無毒無副作用的優(yōu)點，可以作為天然抗氧化劑來使用。但紅薯葉總黃酮對腦缺血缺氧疾病的最大有效給藥劑量和具體的作用機制還有待進一步深入探討。

參?考?文?獻

[1]?王曉煒，鄭俊霞，魏小龍，等.抗缺氧藥物的研究進展[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2009，3（21）：187-189.

[2]?黃盛藍，張家豪，梁冰雪，等.紅薯葉應(yīng)用價值及開發(fā)利用現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2014（19）：309-311，313.

[3]?李蕓達，顏祖弟，黃?濤，等.羌活不同提取物對小鼠腦缺血缺氧的保護作用[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2015，35（4）：296-299.

[4]?李?光，余?霜，陳慶富.正交設(shè)計在紅薯葉黃酮提取中的應(yīng)用[J].北方園藝，2012（1）：41-42.

[5]?李?紅，石貞玉，李瑞玲，等.缺血、缺氧對小鼠海馬DNA甲基化的影響[J].解剖學(xué)報，2016，47（3）：289-294.

[6]?Zalewska T，Jaworska J，Ziemka-Nalecz M.Current and experimental pharmacological approaches in neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy[J].Curr Pharm Des，2015，21（11）：1433-1439.

[7]?譚安雄，朱耀斌，李小云.芒果苷對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用[J].中國醫(yī)藥藥學(xué)雜志，2011，31（23）：1928-1930.

[8]?李?哲，李君文，襲著革，等.缺氧損傷機制研究進展[J].解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，29（2）：145-148.

[9]?Hu C，Zhang Y，Kitts D.Evaluation of antioxidant and prooxidant activities of bamboo Phyllostachys nigra var.henonis leaf extract in vitro[J].Agric Food Chem，2000，48（8）：3170-3176.

[10]?趙?蕊，李青旺，張?濤.紅薯葉黃酮對老齡糖尿病模型大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[J].中國老年學(xué)雜志，2010，30（10）：1395-1396.

[11]?馮彩寧.紅薯葉黃酮降血糖作用研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2009.

[12]?孫小新.不同組分紅薯葉黃酮降血糖作用的研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2010.

[13]?李?霞，程江霞，鮑?磊，等.右美托咪定對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、NGF、BDNF 表達的影響[J].實用臨床醫(yī)藥雜志，2016，20（1）：13-15.