梁麗英 陳晶 陳朝

【摘要】?目的?觀察三七總皂苷（PNS）對肝癌細胞 BEL-7404 細胞線粒體膜電位、凋亡、Caspase-3、Caspase-9表達的影響，并探討其誘導(dǎo)肝癌細胞BEL-7404 凋亡的機制。方法?將BEL-7404細胞分為：對照組、模型組、PNS組。對照組不加藥物培養(yǎng)，模型組加阿霉素（10 μg/mL）培養(yǎng)，PNS 組用不同濃度 PNS 作用于BEL-7404 細胞。CCK-8測定細胞抑制率、流式細胞術(shù)檢測凋亡、線粒體膜電位，ELISA法檢測 Caspase-3、Caspase-9表達。結(jié)果?不同濃度的PNS均可降低BEL-7404細胞線粒體膜電位，100 μg/mL的PNS作用肝癌細胞48 h后，細胞線粒體膜電位較對照組降低 （P<0.01），隨著PNS濃度的增大，細胞凋亡率較對照組升高 （P<0.01）。與對照組比較，PNS 對BEL-7404細胞Caspase-3、Caspase-9的表達均有不同程度的增加。20 μg/mL的PNS作用于BEL-7404細胞48 h后，Caspase-9的表達量較對照組上升（P<0.05）;40 μg/mL的PNS作用于BEL-7404細胞48 h后Caspase-3的表達量較對照組上升（P<0.05）。結(jié)論?一定劑量的三七總皂苷能降低BEL-7404細胞線粒體膜電位，可能是活化Caspase-9后激活凋亡因子caspase-3而導(dǎo)致細胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】?三七總皂苷;線粒體膜電位;肝癌細胞;凋亡;Caspase-3;Caspase-9

中圖分類號：R735.7?文獻標(biāo)識碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.06.001

三七總皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）是從五加科人參屬多年生草本植物三七中提取的主要有效成分，有活血祛瘀、活絡(luò)通脈等功效。國內(nèi)外科學(xué)家對三七的藥理作用進行了廣泛研究，發(fā)表了大量的研究報告，揭示了三七在血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)以及抗炎、抗衰老等方面的生理活性。國內(nèi)有研究指出[1～3]，中藥三七有誘導(dǎo)癌細胞凋亡的作用，但在抗腫瘤方面的實驗研究還沒有得到廣泛的開展，其誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的途徑和靶點仍缺乏深入研究。本實驗以體外培養(yǎng)的細胞株BEL-7404人肝癌細胞為研究對象，探討不同濃度的 PNS作用于人肝癌細胞株后，通過對線粒體膜電位及Caspase-9、Caspase-3相關(guān)活化因子的影響探索其誘導(dǎo)細胞凋亡的作用機制。

1?實驗材料與方法

1.1?藥物及材料

人肝癌細胞株BEL-7404細胞（上海細胞庫提供）;1640培養(yǎng)基購自 Gibco 公司;胎牛血清購自Gibco 公司;二甲基亞砜（DMSO）購自 Sigma 公司;線粒體膜電位檢測試劑盒、凋亡試劑盒購自BD公司;Caspase-3、Caspase-9 ELISA試劑盒購自武漢博士德公司;CCK-8試劑盒購自日本同仁公司。

1.2?儀器設(shè)備

流式細胞儀（美國貝克曼，CytoFlex）、低溫高速離心機（德國eppendorf）、生物安全柜（博訊）、CO2培養(yǎng)箱（賽默飛）、酶標(biāo)儀（賽默飛）。

1.3?實驗方法

1.3.1?細胞培養(yǎng)及處理

人肝癌細胞BEL-7404貼壁生長于PRMI-1640培養(yǎng)液中，其內(nèi)包含有 100 U/mL鏈霉素，100 U/mL青霉素，濃度為10%胎牛血清。3～4天傳代換液一次。凍存：取對數(shù)生長期細胞，0.25%的胰酶消化制成細胞懸液，移至離心管，1000 rpm離心10 min，棄上清，加入1 mL凍存液，用吸管吹打均勻制成細胞懸液，細胞濃度為106個/mL。轉(zhuǎn)入到凍存管，置液氮中保存。復(fù)蘇：液氮中取出的凍存管，1分鐘內(nèi)使其溶化，將細胞懸液移入無菌離心管中，1000 rpm離心5 min，棄上清，沉淀加5 mL培養(yǎng)液，吹打、離心、棄上清。加入 10 mL 全培養(yǎng)基重懸，輕微吹打均勻，將細胞懸液移入培養(yǎng)瓶中，置于5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3.2?實驗分組

①對照組：包含有細胞的培養(yǎng)基、無藥物;②細胞陽模組：包含有細胞的培養(yǎng)基、加阿霉素（10 μg/mL）;③PNS組：選擇 PNS標(biāo)準品（由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實驗室統(tǒng)一購買），參閱相關(guān)文獻及預(yù)實驗結(jié)果，選擇PNS的終濃度為 20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL。

1.3.3?細胞生長抑制率測定

取對數(shù)生長期細胞BEL-7404，待細胞貼壁率達到90%以上時，胰酶消化，制成細胞懸液，再將細胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，1000 rpm/min 離心5 min。棄去上清液，加入適量含 10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，計數(shù)板計數(shù)細胞，將 1.0×104個/mL細胞加入96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，按實驗分組加藥，每孔終體積為200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入CCK-8試劑10 μL反應(yīng)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀在波長450 nm處測OD值，計算細胞生長抑制率。

1.3.4?流式細胞儀檢測細胞凋亡

取對數(shù)生長期的細胞以1×105個/mL密度接種于 6 孔培養(yǎng)板中，貼壁過夜，經(jīng)藥物孵育48 h后用0.25%無EDTA的胰酶消化收集所有細胞，每樣本細胞數(shù)大于1×105個/mL，用預(yù)冷的PBS洗1次后，加 400 μL結(jié)合緩沖液，輕輕混勻細胞后加2.5 μL Annexin-FITC和2.5 μL PI，避光孵育20 min后立即進行流式細胞儀檢測，計算細胞凋亡率。

1.3.5?線粒體膜電位檢測

取對數(shù)生長期的細胞以1×105個/mL的密度接種于6 孔培養(yǎng)板中，貼壁過夜，經(jīng)藥物孵育48 h后用 0.25%無EDTA的胰酶消化收集所有細胞，每樣本細胞數(shù)大于 1×105個/mL，用預(yù)冷的PBS洗1次：①將JC-1染料溶于二甲基亞砜（DMSO）中，制備成濃度為1 μg/μL的JC-1工作液。②將100 μL細胞懸液（105個/mL）加入5 mL的流式測定管中，同時設(shè)陰性對照管。③在測定管中加入1 μL JC-1工作液，陰性對照管不加，輕輕混勻。④將測定管和陰性對照管置于培養(yǎng)箱中孵育15～20 min。⑤吸取500 μL PBS緩沖液分別加入測定管和對照管中，1000 rpm/mim，離心5 min，棄上清，重懸細胞。用流式細胞儀檢測。流式細胞儀激發(fā)波為488 nm，紅色熒光的最大發(fā)射波長為580/590 nm，綠色熒光的最大發(fā)射波長為510/527 nm，以紅/綠熒光強度比值代表細胞線粒體膜電位的強度。

1.3.6?ELISA法檢測Caspase-3、Caspase-9的活性

取對數(shù)生長期的細胞以1×105個/mL的密度接種于 6 孔培養(yǎng)板中，貼壁過夜，經(jīng)藥物孵育48 h后用 0.25%無EDTA的胰酶消化收集所有細胞，每樣本細胞數(shù)大于1×105個/mL，用預(yù)冷的PBS洗1次，將細胞重懸于0.5 mL PBS中，-20℃凍存過夜，4℃解凍，反復(fù)三次。3000 rpm/min，10 min，離心，取上清，按ELISA試劑盒說明書要求檢測。

1.4?統(tǒng)計學(xué)分析

細胞生長抑制實驗每個濃度組設(shè)5個平行孔，其余實驗設(shè)3個平行孔，使用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準差（±s） 表示，多組間比較使用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準：α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2?結(jié)果

2.1?細胞生長抑制率的測定

單因素方差分析顯示，6組在24 h、48 h、72 h細胞生長抑制率的比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），根據(jù)抑制的程度及作用時間，選擇用藥48 h作為后續(xù)實驗用藥時間。見表1。

2.2?PNS對BEL-7404細胞線粒體膜電位及細胞凋亡的影響

不同濃度的PNS均可降低BEL-7404細胞線粒體膜電位，100 μg/mL的PNS作用于肝癌細胞48 h后，細胞線粒體膜電位較對照組降低 （P<0.01），隨著PNS濃度的增大，細胞凋亡率較對照組升高 （P<0.01）。見表2。

2.3?PNS 對BEL-7404細胞Caspase-3、Caspase-9的影響

與對照組比較，PNS 對BEL-7404細胞Caspase-3、Caspase-9的表達均有不同程度的增加。20 μg/mL的PNS作用于BEL-7404細胞48 h后，Caspase-9的表達量較對照組上升（P<0.05）;40 μg/mL的PNS作用于BEL-7404細胞48 h后Caspase-3的表達量較對照組上升（P<0.05）。見表3。

3?討論

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）簡稱肝癌，是常見的惡性腫瘤之一，肝癌的迅速生長是癌細胞增殖旺盛與凋亡減少的結(jié)果，誘導(dǎo)癌細胞凋亡已成為篩選抗癌藥物的新方向。近年的研究顯示多種中藥可誘導(dǎo)肝癌細胞的凋亡[2～5]，誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的機制，報道比較多的傾向于藥物通過影響肝癌細胞增殖周期和抑制與癌發(fā)生相關(guān)基因的表達來達到防癌和抗癌的目的[6]。三七總皂苷的抗腫瘤作用研究也同樣停留在抑制腫瘤細胞生長或轉(zhuǎn)移等方面，對其誘導(dǎo)癌細胞凋亡的途徑報道及信號傳導(dǎo)甚少，由于其機制不明，未能在臨床廣泛應(yīng)用。因此尋找三七總皂苷誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的途徑和靶點，不僅為肝癌的治療提供了新的方法，同時也為中藥的發(fā)展開辟了新的途徑。

本研究將體外培養(yǎng)的BEL-7404 人肝癌細胞列為研究對象，用不同濃度的三七總皂苷作用于人肝癌細胞，應(yīng)用流式細胞技術(shù)檢測細胞線粒體膜電位的變化，探討三七總皂苷對細胞線粒體膜電位的影響。實驗結(jié)果顯示，PNS 作用于BEL-7404細胞48 h后，與對照組比較，100 μg/mL組抑制率明顯增大，線粒體膜電位降低，80 μg/mL、100 μg/mL組均可顯著誘導(dǎo)BEL-7404細胞的凋亡。線粒體凋亡途徑在細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中是近年來研究的熱門，是細胞凋亡途徑的中心，線粒體膜電位凌亂是細胞凋亡時早期發(fā)生的細胞內(nèi)事件之一，線粒體膜電位的喪失是細胞凋亡發(fā)生的必然途徑[7～8]。隨著研究的深入，最令人關(guān)注的是線粒體在細胞凋亡發(fā)生過程中的作用，以及各種線粒體蛋白在信號傳導(dǎo)中的作用。其中Caspase相關(guān)蛋白在凋亡過程中起重要作用[9]。Caspase-9是凋亡的引發(fā)劑，Caspase-3 是細胞凋亡反應(yīng)中的執(zhí)行者和關(guān)鍵酶，直接參與介導(dǎo)細胞凋亡過程[10]。 通過活化脫氧核糖核酸酶，引起細胞染色體斷裂，發(fā)生細胞凋亡。通過對Caspase-3、Caspase-9的結(jié)果分析顯示，與對照組比較，PNS 作用于BEL-7404細胞48 h后，可以使BEL-7404細胞Caspase-9、Caspase-3表達增加，并且隨濃度增加而增加。

總而言之，三七總皂苷可能通過降低細胞線粒體膜電位，造成線粒體漲大，釋放細胞色素C到細胞液中，與凋亡蛋白酶激活因子（Apaf-1）連接，并與procaspase-9聚集，導(dǎo)致Caspase-9的活化，活化的Caspase-9激活Cappase-3而導(dǎo)致細胞凋亡，產(chǎn)生抑制腫瘤細胞增殖的作用。本研究以線粒體膜電位作為新的切入點，通過與其相關(guān)的Caspase蛋白研究三七總皂苷的藥理作用，將有助于發(fā)現(xiàn)三七總皂苷作用的新靶點和進一步闡明三七總皂苷防治肝癌的分子藥理機制，為三七總皂苷對腫瘤細胞的作用靶點提供實驗依據(jù)，有助于為三七應(yīng)用于防治肝癌及預(yù)防提供理論依據(jù)，并在此基礎(chǔ)上建立相關(guān)的中藥藥效篩選的細胞和分子模型。

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