黃 浩，陳文江，劉長(zhǎng)召，王 玲，沈艷芳

(1.湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院心血管病中心 445000；2.廣東醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣東湛江 524023；3.湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院健康體檢中心 445000)

急性心肌梗死(AMI)是冠狀動(dòng)脈閉塞，血流中斷，造成部分心肌因嚴(yán)重持久性缺血而發(fā)生局部壞死，為心內(nèi)科常見致死性疾病[1-2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)微小 RNA(miRNA) 與心血管系統(tǒng)的生長(zhǎng)、發(fā)育和心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-6]。有研究報(bào)道，循環(huán)微小RNA(miR)-19a-3p可能參與AMI、心肌肥厚、肺動(dòng)脈高壓、心房顫動(dòng)等疾病發(fā)生，并可調(diào)控心肌細(xì)胞分化和維持心臟功能[7-9]。近幾年AMI發(fā)病機(jī)制研究較多，多數(shù)認(rèn)為miR-19a-3p可作為AMI的標(biāo)志物用于臨床診治[10]。本研究前期結(jié)果表明，miR-19a-3p的靶基因可能為低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白2(LRP2)；其生物信息功能主要與脂質(zhì)生物合成過程(lipid biosynthetic process)、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路(adipocytokine signaling pathway、interleukin signaling pathway)、缺氧誘導(dǎo)因子介導(dǎo)缺氧反應(yīng)(hypoxia response via HIF activation)、血管生成(Angiogenesis)、mTOR信號(hào)通路(mTOR signaling pathway)、MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路(TGF-beta signaling pathway)、化學(xué)因子信號(hào)通路(chemokine signaling pathway)等有關(guān)。心肌缺氧是AMI的主要病理?yè)p傷，心肌細(xì)胞在不同程度和時(shí)間的缺氧條件下可引起心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死，從而影響心臟功能[6,11- 12]。本研究擬對(duì)不同時(shí)間缺氧條件下H9C2心肌細(xì)胞中miR-19a-3p的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，探討其具體發(fā)病機(jī)制，并分析miR-19a-3p與LRP2的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠H9C2心肌細(xì)胞株購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，采用低糖DMEM培養(yǎng)基(含 10% FBS和1%的雙抗)，培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2，1% O2)中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞培養(yǎng)至第6代后，按不同缺氧時(shí)間分為7組：缺氧0、4、8、12、16、20、24 h，每組8個(gè)60 mm培養(yǎng)皿。達(dá)到缺氧時(shí)間后立即取出，每組取4個(gè)培養(yǎng)皿加入Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)裂解細(xì)胞，按照說明書提取總RNA，―80 ℃保存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。每組的另外4個(gè)培養(yǎng)皿加入RIPA細(xì)胞裂解液(碧云天公司)，按照說明書提取蛋白，―20 ℃保存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2miR-19a-3p實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè) 培養(yǎng)液miRNA提取采用天根生物有限公司提供的試劑盒進(jìn)行提取，細(xì)胞總RNA按照試劑盒采用Trizol試劑進(jìn)行提取，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根生物有限公司)說明書反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，熒光定量試劑盒(天根生物有限公司)說明書進(jìn)行miR-19a-3p表達(dá)水平的檢測(cè)。熒光定量檢測(cè)條件：94 ℃變性2 min；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)循環(huán)中模板94 ℃變性20 s；60 ℃退火、延伸34 s；共30個(gè)循環(huán)。rno-miR-19a-3p(MIMAT0000789，UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA)及內(nèi)參U6的引物均為天根生物有限公司提供。本研究采用2-△Ct相對(duì)定量方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析：△Ct(實(shí)驗(yàn)組)=Ct(實(shí)驗(yàn)組目標(biāo)基因)―Ct(實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因)；△Ct(對(duì)照組)=Ct(對(duì)照組目標(biāo)基因)―Ct(對(duì)照組內(nèi)參基因)。

1.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 采用ELISA檢測(cè)LRP2，采用ELISA試劑盒(DLDEVELOP，DL-LRP2-Hu)，檢測(cè)范圍0.625～40.000 ng/mL，由上?？道噬锟萍加邢薰咎峁?，按照試劑盒說明書進(jìn)行相關(guān)具體步驟的操作。

1.4LRP2 mRNA的qRT-PCR檢測(cè) 將所提取細(xì)胞的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根生物有限公司)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR試劑盒(天根生物有限公司)說明書進(jìn)行熒光定量：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃擴(kuò)增，延伸15 s；60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)，LRP2與內(nèi)參GAPDH引物均由天根生物有限公司提供。LRP2上游引物：AGC TCT TCT GCT GAT GGA CC，下游引物：TGT ACA CAT TTA GCC ACA GGG C，擴(kuò)增片段為289 kb，數(shù)據(jù)分析方法與miRNA實(shí)時(shí)熒光定量相同。

1.5Western Blot 將提取的不同組間的蛋白質(zhì)采用BCA法檢測(cè)蛋白含量后，進(jìn)行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、LRP2 1抗(購(gòu)自武漢博士德生物有限公司)孵育過夜，次日復(fù)溫1 h，然后2抗孵育、曝光。LRP2稀釋比例為1∶500，選用GAPDH作為內(nèi)參(稀釋比例1∶1 000，購(gòu)自武漢博士德生物有限公司)，其余相關(guān)試劑和材料均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。采用Image J圖像分析軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值，最后統(tǒng)計(jì)結(jié)果為目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1qRT-PCR檢測(cè)miR-19a-3p 結(jié)果比較 分別對(duì)缺氧0、4、8、12、16、20、24 h的H9C2細(xì)胞培養(yǎng)液中miR-19a-3p進(jìn)行檢測(cè)，H9C2細(xì)胞培養(yǎng)液中miR-19a-3p表達(dá)在缺氧0、4、8、12、16 h差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但缺氧20 h與24 h時(shí)，miR-19a-3p表達(dá)與缺氧0 h比較，明顯升高(P<0.05)；同時(shí)對(duì)H9C2細(xì)胞中miR-19a-3p進(jìn)行檢測(cè)，缺氧20 h與24 h時(shí)，H9C2細(xì)胞中miR-19a-3p的表達(dá)與缺氧0 h比較明顯下降(P<0.05)。見圖1。

2.2ELISA檢測(cè)培養(yǎng)液中LRP2的結(jié)果比較 分別對(duì)缺氧0、4、8、12、16、20、24 h的H9C2細(xì)胞培養(yǎng)液中LRP2進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)H9C2細(xì)胞培養(yǎng)液中LRP2表達(dá)在缺氧16 h后明顯升高，缺氧16 h[(675.2±42.40)ng/mL，n=3]、20 h[(979.4±204.2)ng/mL，n=3]、24 h[(1 456.0±363.6)ng/mL，n=3]與0 h[(245.00±10.84)ng/mL，n=3]比較，明顯升高(P<0.05)。見圖2。

注：H9C2細(xì)胞培養(yǎng)液中miR-19a-3p 表達(dá)與0 h比較，*P<0.05；H9C2細(xì)胞中miR-19a-3p表達(dá)與0 h比較，#P<0.05

圖1實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)miR-19a-3p表達(dá)水平

注：H9C2細(xì)胞培養(yǎng)液中LRP2 表達(dá)與0 h比較，*P<0.05

圖2培養(yǎng)液LRP表達(dá)水平

注：H9C2細(xì)胞中LRP2 表達(dá)與0 h比較，*P<0.05

圖3 qRT-PCR檢測(cè)miR-19a-3p表達(dá)水平

2.3H9C2細(xì)胞中LRP2 mRNA表達(dá)的結(jié)果比較 H9C2細(xì)胞中LRP2表達(dá)在缺氧16 h后明顯升高，缺氧16 h[(0.000 503±0.000 100)ng/mL，n=3]、20 h[(0.001 303±0.000 090)ng/mL，n=3]、24 h[(0.001 617±0.000 110)ng/mL，n=3]與0 h[(0.000 139±0.000 060)ng/mL，n=3]比較，明顯升高(P<0.05)。見圖3。

2.4LRP2蛋白表達(dá)結(jié)果比較 對(duì)0、20、24 h H9C2細(xì)胞中LRP2蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，20 h[(0.235 000±0.003 427)ng/mL，n=3]、24 h[(0.535 000±0.003 427)ng/mL，n=3] LRP2蛋白表達(dá)與0 h[(0.140 10±0.018 21)ng/mL，n=3]比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

注：A表示蛋白印記結(jié)果；B表示相應(yīng)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，***P<0.000 1

圖4 LRP2蛋白表達(dá)水平

3 討 論

隨著生活水平的提高及人口老齡化的加速發(fā)展，我國(guó)AMI發(fā)病率持續(xù)升高，其將帶來嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[13]。近年來關(guān)于miRNA與AMI的研究較多，大量miRNA可能參與AMI的發(fā)生、發(fā)展，如miR-1、miR-126、miR-133a/b、miR-134、miR-150、miR-19a/b、miR-200、miR-208a、miR-223、miR-320a、miR-499、miR-486等都可能參與了AMI的發(fā)病機(jī)制[14-18]。隨著循環(huán)miRNA(主要指血漿、血清、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)液等miRNA)的發(fā)現(xiàn)，大量研究表明循環(huán)miRNA與AMI的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，并可作為AMI的生物標(biāo)志物，尤其是循環(huán)miR-1、miR-133a/b、miR-208a、miR-499的研究較為成熟[19-22]。最近也有研究報(bào)道m(xù)iR-19a-3p與AMI發(fā)病高度相關(guān)，且血漿和血清中的miR-19a-3p也可能與AMI有關(guān)[10]。本研究從AMI病理生理分析，采用H9C2細(xì)胞缺氧在細(xì)胞水平模擬AMI過程，對(duì)細(xì)胞水平和循環(huán)miRNA水平(培養(yǎng)液)進(jìn)行miR-19a-3p檢測(cè)，分別對(duì)缺氧0、4、8、12、16、20、24 h的H9C2細(xì)胞培養(yǎng)液中miR-19a-3p進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果表明H9C2細(xì)胞培養(yǎng)液中miR-19a-3p的表達(dá)在缺氧0、4、8、12、16 h時(shí)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，未見明顯變化；而缺氧20、24 h時(shí)，miR-19a-3p表達(dá)與缺氧0 h比較，明顯升高(P<0.05)。同時(shí)對(duì)H9C2細(xì)胞中的miR-19a-3p進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示缺氧20、24 h時(shí)，H9C2細(xì)胞中miR-19a-3p表達(dá)與缺氧0 h比較，明顯下降(P<0.05)，證實(shí)H9C2細(xì)胞中miR-19a-3p的表達(dá)隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而下降，但培養(yǎng)液中循環(huán)miR-19a-3p表達(dá)卻相應(yīng)升高，與有關(guān)研究一致，提示miR-19a-3p可能與AMI有關(guān)。

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，LRP2可能為miR-19a-3p的靶基因，且LRP2生物信息學(xué)功能主要是參與lipoprotein transporter activity、low-density lipoprotein receptor activity、lipid metabolic process、lipoprotein transport、coronary vasculature development、aorta development、cell proliferation、ventricular septum development、clathrin-coated vesicle membrane、lysosome等，可見其與脂蛋白代謝和冠狀動(dòng)脈發(fā)育等密切相關(guān)，可能也與AMI發(fā)病機(jī)制有關(guān)[23-24]。本研究分別對(duì)缺氧0、4、8、12、16、20、24 h的H9C2細(xì)胞培養(yǎng)液中LRP2進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明H9C2細(xì)胞中LRP2表達(dá)在缺氧16 h后明顯升高，缺氧16、20、24 h較0 h明顯升高(P<0.05)，且在H9C2細(xì)胞中進(jìn)行mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)均顯示，LRP2表達(dá)在20、24 h較0 h時(shí)明顯升高(P<0.05)，結(jié)合miR-19a-3p逐漸低表達(dá)的結(jié)果，提示LRP2可能為miR-19a-3p的靶基因，且LRP2可能也與H9C2細(xì)胞缺氧損傷密切相關(guān)。

生物信息學(xué)顯示LRP2在正常組織中(HPA RNA-seq normal tissues，BioProject:PRJEB4337)主要表達(dá)于腎臟、甲狀腺、大腦等，心臟表達(dá)較少；通過對(duì)胚胎發(fā)育過程中組織(tissue-specific circular RNA induction during human fetal development，BioProject:PRJNA270632)進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，LRP2主要在心臟、腎臟、肺組織中高表達(dá)。提示LRP2可能還參與了其他系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育和疾病的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，miR-19a-3p在H9C2細(xì)胞缺氧后差異性表達(dá)，其在H9C2細(xì)胞中低表達(dá)，在培養(yǎng)液中循環(huán)miR-19a-3p水平高表達(dá)，其靶基因可能為L(zhǎng)RP2，后者在H9C2細(xì)胞缺氧后高表達(dá)，為AMI的發(fā)病機(jī)制提供了相關(guān)理論依據(jù)。本研究只是一個(gè)初步研究，關(guān)于miR-19a-3p在H9C2細(xì)胞中逐漸低表達(dá)而在培養(yǎng)液中逐漸高表達(dá)的機(jī)制也未進(jìn)行探討，可能與細(xì)胞旁分泌、外泌體運(yùn)輸或細(xì)胞破裂等有關(guān)。對(duì)于miR-19a-3p如何具體通過調(diào)控LRP2導(dǎo)致H9C2細(xì)胞缺氧損傷的過程還有待深入的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

[1]ZHOU M,WANG H,ZHU J,et al.Cause-specific mortality for 240 causes in China during 1990-2013:a systematic subnational analysis for the Global Burden of Disease Study 2013[J].Lancet,2016,387(115):251-272.

[2]陳偉偉，高潤(rùn)霖，劉力生，等．《中國(guó)心血管病報(bào)告2015》概要[J]．中國(guó)循環(huán)雜志，2016，31(6)：521-528．

[3]WANG J,CHEN J,SEN S.MicroRNA as biomarkers and diagnostics[J].J Cell Physiol,2016,231(1):25-30.

[4]NAVICKAS R,GAL D,LAUCEVICIUS A A,et al.Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease:a systematic review[J].Cardiovasc Res,2016,111(4):322-337.

[5]陳文江，陳燦．微RNA與心房顫動(dòng)發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J]．醫(yī)學(xué)綜述，2015,19(5)：801-803．

[6]嚴(yán)泉祥，陳文江，陳燦．microRNAs參與干細(xì)胞治療心肌梗死的研究進(jìn)展[J]．廣東醫(yī)學(xué)，2015,33(22)：3549-3551．

[7]LI S,REN J,XU N,et al.MicroRNA-19b functions as potential anti-thrombotic Protector in patients with unstable angina by targeting tissue factor[J].J Mol Cell Cardiol,2014,75(34):49-57.

[8]陳燦．TGF-β1/SMAD3及其靶向調(diào)控microRNA表達(dá)量與冠心病易感性的關(guān)聯(lián)關(guān)系及機(jī)制研究[D]．武漢：武漢大學(xué)，2014．

[9]ZHONG J,HE Y,CHEN W,et al.Circulating microRNA-19a as a potential novel biomarker for diagnosis of acute myocardial infarction[J].Int J Mol Sci,2014,15(11):20355-20364.

[10]劉肖肖，楊承健，韓志君．MiocroRNA與心肌梗死的心臟病理特征研究進(jìn)展[J]．臨床心血管病雜志，2015,20(9)：928-931．

[11]王晶，韓雪晶，賈克剛，等．循環(huán)microRNA-126作為急性心肌梗死早期診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的研究[J/CD]．中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2015,8(3)：409-414．

[12]隋輝，陳偉偉，王文．《中國(guó)心血管病報(bào)告2014》要點(diǎn)介紹[J]．中華高血壓雜志，2015,25(7)：627-629．

[13]KONDKAR A A,ABU-AMERO K K.Utility of circulating microRNAs as clinical biomarkers for cardiovascular diseases[J].Biomed Res Int,2015,43(12):821-823.

[14]DEVAUX Y,MUELLER M,HAAF P,et al.Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain[J].J Intern Med,2015,277(2):260-271.

[15]LIU X,FAN Z,ZHAO T,et al.Plasma miR-1,miR-208,miR-499 as potential predictive biomarkers for acute myocardial infarction:An Independent study of Han population[J].Exp Gerontol,2015,72(10):230-238.

[16]劉長(zhǎng)召，王玲，陳文江．大鼠心肌梗死后與FSTL1和miRNA-200的表達(dá)及其機(jī)制[J]．西部醫(yī)學(xué)，2017，29(3)：316-321．

[17]劉長(zhǎng)召，王玲，陳文江．大鼠心肌細(xì)胞缺氧后miR-133a-3p的表達(dá)及其下游靶基因預(yù)測(cè)[J]．局解手術(shù)學(xué)雜志，2016,16(11)：784-788．

[18]XIN Y,YANG C,HAN Z.Circulating miR-499 as a potential biomarker for acute myocardial infarction[J].Ann Transla Med,2016,4(7):135-138.

[19]章麗珠，陳曦，葉新和，等．循環(huán)microRNA-499與急性心肌梗死診斷的相關(guān)性[J]．臨床心血管病雜志，2015,21(4)：395-399．

[20]ZHANG L,CHEN X,SU T,et al.Circulating miR-499 are novel and sensitive biomarker of acute myocardial infarction[J].J Thorac Dis,2015,7(3):303-308.

[21]許浩軍，顧明，于宗良，等．循環(huán)miRNA檢測(cè)在診斷急性冠脈綜合征中的意義[J]．江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2014，24(1)：59-62．

[22]BAARDMANME,ZWIERMV,WISSE

L J,et al.Common arterial trunk and ventricular non-compaction in Lrp2 knockout mice indicate a crucial role of LRP2 in cardiac development[J].Dis Model Mech,2016,9(4):413-425.

[23]CASES O,OBRY A,BEN-YACOUB S,et al.Impaired vitreous composition and retinal pigment epithelium function in the FoxG1:LRP2 myopic mice[J].Biochim Biophys Acta,2017,34(8):1120-1125.

[24]ZHANG B,WANG L L,REN R J,et al.MicroRNA-146a represses LRP2 translation and leads to cell apoptosis in Alzheimer′s disease[J].FEBS Lett,2016,590(14):2190-2200.