郎秀娟，王燕

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，哈爾濱 150081

線粒體是真核生物的重要供能器官，對細(xì)胞內(nèi)能量產(chǎn)生、新陳代謝、細(xì)胞死亡等過程極為重要。此外，線粒體也會(huì)產(chǎn)生有害物質(zhì)——活性氧(reactive oxygen species，ROS)，并隔離促凋亡因子，對細(xì)胞生存造成消極影響[1]。線粒體維持其功能和活性的這一生理過程稱為線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)[2]。真核生物具有精細(xì)的調(diào)控系統(tǒng)以維持自身穩(wěn)態(tài)，其中線粒體自噬是調(diào)控線粒體穩(wěn)態(tài)的重要途徑。一旦線粒體受損、衰老或喪失正常功能，細(xì)胞會(huì)利用自噬機(jī)制將其選擇性清除，稱為線粒體自噬[3]。

1 自噬和線粒體自噬

自噬是真核生物的常規(guī)機(jī)制， Ohsumi對其進(jìn)行了深入研究，并于2016年被授予諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)[4]。自噬的主要功能是清除細(xì)胞內(nèi)成分，包括胞質(zhì)、聚集的蛋白及細(xì)胞器。目前，自噬主要有3種類型，包括分子伴侶介導(dǎo)的自噬、巨自噬及微自噬[5]。在巨自噬中，單獨(dú)的細(xì)胞內(nèi)組分會(huì)被雙層膜結(jié)構(gòu)圍繞，稱為自噬體。自噬體與溶酶體融合，利用溶酶體酶將其內(nèi)部成分降解。這種非選擇性的降解主要發(fā)生于饑餓時(shí)，通過回收并利用細(xì)胞內(nèi)組分為細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)。微自噬指溶酶體膜內(nèi)陷，直接吞噬細(xì)胞內(nèi)組分。分子伴侶介導(dǎo)的自噬主要指胞質(zhì)內(nèi)蛋白結(jié)合到分子伴侶后被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體進(jìn)行降解[6]。

線粒體自噬主要通過巨自噬清除多余和受損的線粒體[7-8]。目前已知調(diào)控哺乳動(dòng)物中線粒體自噬的機(jī)制主要有兩種：一種是parkin依賴性的，即parkin (E3 ubiquitin-protein ligase parkin)與線粒體外膜蛋白PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)介導(dǎo)的線粒體自噬[7]；另一種是parkin非依賴性的，包括FUNDC1參與的缺氧介導(dǎo)的線粒體自噬及Bnip3/Nix介導(dǎo)的線粒體自噬[9]。近幾年研究表明，PINK1和parkin是調(diào)控線粒體自噬的重要組分，有助于維持線粒體正常功能。

2 PINK1/parkin的分子結(jié)構(gòu)和功能

PINK1和parkin是帕金森病的主要致病蛋白，其編碼基因已成為神經(jīng)退行性疾病的主要遺傳性危險(xiǎn)因子[10]。PINK1是由581個(gè)氨基酸組成的多肽，其N端類似于線粒體靶定信號(hào)，后面連接一段疏水跨膜區(qū)，作為線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)移終止信號(hào)，156～509之間的殘基構(gòu)成絲氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu)域，后面是C端結(jié)構(gòu)域，作為線粒體外膜滯留信號(hào)。在正常線粒體中，PINK1會(huì)不斷被轉(zhuǎn)移至線粒體內(nèi)膜，被線粒體內(nèi)膜蛋白酶PARL(presenilin-associated rhomboid-like protein)切割，產(chǎn)生一個(gè)N端降解基序，隨后被清除[11]。因此，正常情況下PINK1含量極低，很難被檢測到。然而，線粒體膜電位受損時(shí)，PINK1進(jìn)入線粒體內(nèi)膜的路徑被阻斷，PINK1聚集于線粒體外膜，并將parkin募集至受損線粒體。

Parkin是E3泛素連接酶，結(jié)構(gòu)包括Ubl、RING0、RING1、IBR和RING2區(qū)。其中Ubl區(qū)主要功能包括識(shí)別基質(zhì)、聯(lián)合蛋白酶體、結(jié)合SH3和泛素蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)parkin水平和活性[12]。穩(wěn)態(tài)條件下，parkin通過以下兩種機(jī)制維持自身被抑制的狀態(tài)：第一種是RING0區(qū)域?qū)⒎核氐鞍资荏w位點(diǎn)半胱氨酸掩藏起來；第二種是所謂的parkin抑制因子，一段位于IBR和RING2區(qū)域的α螺旋結(jié)構(gòu)，阻斷RING1區(qū)域的E2結(jié)合位點(diǎn)。線粒體損傷后，parkin的空間構(gòu)象發(fā)生改變，起催化作用的半胱氨酸暴露，并轉(zhuǎn)化為呈活化狀態(tài)的E3泛素連接酶[13-14]。

3 PINK1/parkin信號(hào)通路

3.1 PINK1是線粒體損傷的主要探測器

正常情況下，PINK1表達(dá)水平極低，無法被檢測到。在特定線粒體應(yīng)激情況下，只有內(nèi)源性PINK1表達(dá)水平增加到一定程度才可通過蛋白免疫印跡法或顯微鏡被檢測到，且其主要定位于線粒體外膜。

受損線粒體的主要特點(diǎn)是失去呼吸鏈產(chǎn)生的膜電位。用羰基氰化物間氯苯腙(carbonylcyanide-m-chlorophenylhydrazone，CCCP)或羰基-氰-對-三氟甲氧基本腙(carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone，F(xiàn)CCP)處理細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致呼吸鏈解偶聯(lián)，使線粒體功能發(fā)生障礙。其他類型線粒體缺陷也會(huì)導(dǎo)致PINK1聚集于線粒體，如ROS水平增加或錯(cuò)誤折疊的蛋白聚集于線粒體基質(zhì)[15-16]。

PINK1顯著聚集于電勢降低的線粒體中，表明其可能是線粒體損傷的主要探測器。用CCCP/FCCP處理細(xì)胞3 h后，能檢測到內(nèi)源性PINK1蛋白的自身積累；而處理細(xì)胞12～16 h后，PINK1表達(dá)量達(dá)最高水平。移除CCCP/FCCP后，由于PARL蛋白酶激活，PINK1數(shù)量快速下降至低水平[17]。用CCCP處理細(xì)胞時(shí)，蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，相比于外源表達(dá)的PINK1，內(nèi)源性PINK1全長條帶輕微升高，表明聚集的PINK1分子可能發(fā)生自體磷酸化[18]。

線粒體功能紊亂時(shí)，細(xì)胞內(nèi)PINK1蛋白表達(dá)水平顯著增加，但原因未知。有研究[19]認(rèn)為，正常情況下PINK1通過TOM/TIM復(fù)合體進(jìn)入線粒體，被定位于線粒體內(nèi)膜的蛋白酶PARL切割降解；而功能紊亂的線粒體膜電位降低，PINK1不能進(jìn)入線粒體內(nèi)膜，積累于線粒體外膜。

3.2 PINK1/parkin協(xié)同調(diào)控線粒體自噬發(fā)生

果蠅敲除模型實(shí)驗(yàn)首次明確PINK1與parkin的相互作用，即共同調(diào)控線粒體自噬，進(jìn)而維持線粒體質(zhì)量。PINK1和parkin這兩種蛋白缺失任何一種都會(huì)造成線粒體受損，包括果蠅肌肉退化及線粒體形態(tài)異常。然而，過表達(dá)parkin可恢復(fù)一部分PINK1缺失的表型，而PINK1無法彌補(bǔ)parkin缺失造成的損傷。因此，推測PINK1位于parkin上游發(fā)揮作用，兩者協(xié)同調(diào)控線粒體自噬[20]。人類細(xì)胞暴露于CCCP后會(huì)缺失膜電位，PINK1介導(dǎo)parkin從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到損傷的線粒體外膜。此時(shí)，parkin受抑制的泛素連接酶功能被活化，進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞器的移除[21]。

Narendra等[22]證明，環(huán)己酰亞胺(cycloheximide，CHX)可通過抑制蛋白合成而阻斷CCCP誘導(dǎo)的PINK1和parkin聚集，表明PINK1蛋白水平增加可歸因于新多肽的生物合成，但該結(jié)論仍需進(jìn)一步明確。近期研究[23]表明，PINK1和parkin在細(xì)胞中的表達(dá)水平是轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的基礎(chǔ)，生長因子缺失、饑餓或其他細(xì)胞受損均會(huì)誘導(dǎo)PINK1和parkin的轉(zhuǎn)位。

3.3 PINK1募集并活化parkin

研究[24]證實(shí)，PINK1可通過parkin磷酸化介導(dǎo)其轉(zhuǎn)移至線粒體，隨后誘導(dǎo)線粒體自噬等過程。首先，線粒體發(fā)生去膜電位后，PINK1絲氨酸228和絲氨酸402位點(diǎn)發(fā)生自體磷酸化，這是募集parkin所必需的。其次，PINK1可直接磷酸化parkin Ubl區(qū)的絲氨酸65位點(diǎn)[25]。有趣的是，將parkin絲氨酸65位點(diǎn)突變?yōu)楸彼嵬Ｖ蛊淞姿峄?，或使其Ubl區(qū)缺失，parkin仍可以PINK1依賴性方式轉(zhuǎn)移至線粒體。最近一項(xiàng)新發(fā)現(xiàn)的機(jī)制可解釋這種現(xiàn)象，即PINK1可磷酸化泛素蛋白絲氨酸65位點(diǎn)(與parkin的Ubl區(qū)絲氨酸65位點(diǎn)具有同源性)；反之，磷酸化的泛素蛋白可活化parkin的E3連接酶活性。那么，parkin活化究竟是由parkin的磷酸化還是泛素蛋白的磷酸化所促進(jìn)的？這一問題仍存在爭議。Kane等[26]證明，泛素蛋白的磷酸化足以活化parkin分子。 Koyano及其同事[27]認(rèn)為，對于完全活化的E3連接酶來說，parkin絲氨酸位點(diǎn)和泛素蛋白絲氨酸位點(diǎn)的磷酸化均是必需的。最近研究表明，parkin首先以PINK1依賴性方式被活化，隨后泛素化線粒體表面蛋白，之后PINK1磷酸化新形成的多聚泛素鏈而產(chǎn)生磷酸泛素蛋白，進(jìn)一步促進(jìn)parkin活化。

穩(wěn)態(tài)條件下，PINK1可抑制線粒體自噬的誘導(dǎo)[28]。這一點(diǎn)可通過免疫沉淀法證明，PINK1在線粒體內(nèi)產(chǎn)生相對分子質(zhì)量為 53 000 的切割產(chǎn)物PINK1-PF，隨后PINK1-PF轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)并結(jié)合parkin，進(jìn)而抑制parkin轉(zhuǎn)移至線粒體及隨后誘導(dǎo)線粒體自噬過程。

3.4 Parkin泛素化線粒體外膜蛋白，進(jìn)一步引發(fā)線粒體自噬

隨著parkin的募集與活化，其被認(rèn)為是線粒體外膜的非特異性泛素蛋白。蛋白質(zhì)組學(xué)研究證明，廣泛的泛素基質(zhì)均通過parkin進(jìn)行泛素化，而在誘導(dǎo)線粒體自噬方面，廣泛的泛素化比特異性基質(zhì)的泛素化更重要[29]。Parkin泛素化線粒體外膜蛋白會(huì)進(jìn)一步引發(fā)線粒體自噬，利用自噬清除整個(gè)被標(biāo)記的器官。圍繞受損線粒體的隔離膜的形成由自噬受體介導(dǎo)，這些自噬受體可通過其泛素結(jié)合區(qū)域結(jié)合至泛素蛋白。到目前為止，已明確了幾種在線粒體自噬中有重要作用的受體，包括SQSTM1/P62、NBR1(neighbor of BRCA1 gene)、NDP52 (nuclear dot 52 kDa protein)和OPTN(optineurin)。研究表明，在PINK1/parkin介導(dǎo)的線粒體自噬發(fā)生過程中，p62優(yōu)先定位于鄰近線粒體之間，通過其PB1寡聚結(jié)構(gòu)域促進(jìn)受損線粒體的聚積[30]。敲除p62，對parkin募集至線粒體這一過程無影響，但影響受損線粒體的最終清除。NBR1是連接LC3與泛素蛋白的另一蛋白，與p62協(xié)同參與線粒體自噬過程[31]。NBR1與p62在PINK1/parkin介導(dǎo)的線粒體自噬過程中是非必需的。研究[32]表明，NDP52和OPTN是PINK1/parkin介導(dǎo)線粒體自噬過程的主要受體，線粒體的有效清除需它們參與。與p62的作用不同，NDP52和OPTN主要定位于受損線粒體的表面，作為自噬受體，促進(jìn)LC3募集至受損線粒體，加速受損線粒體被自噬體吞噬并清除的過程。在PINK1/parkin介導(dǎo)的線粒體自噬過程中，OPTN的功能依賴TBK1(Tank-binding kinase 1)對其磷酸化的作用，反之，TBK1的活化需OPTN募集和磷酸化，兩者相互調(diào)節(jié)，促進(jìn)線粒體自噬發(fā)生[33-34]。

Youle等最近研究表明，敲除線粒體分解蛋白Drp1促進(jìn)parkin轉(zhuǎn)位至線粒體，加速線粒體自噬發(fā)生；并提出新觀點(diǎn)，即線粒體分解可保護(hù)線粒體未受損傷的結(jié)構(gòu)，從而維持線粒體穩(wěn)態(tài)[35]。

Parkin的拮抗劑是去泛素化酶USP30，能移除線粒體外膜蛋白的泛素化分子，并因此抑制線粒體自噬。抑制USP30可促進(jìn)線粒體損傷及其自噬，增強(qiáng)對線粒體的質(zhì)量調(diào)控，與治療帕金森病的方法相關(guān)[36]。

3.5 PINK1介導(dǎo)parkin非依賴性線粒體自噬

PINK1基因敲除小鼠呈現(xiàn)連續(xù)性的神經(jīng)退行性病變，而parkin基因敲除小鼠未發(fā)生神經(jīng)性病變，表明存在其他PINK1依賴性磷酸化位點(diǎn)，可代償parkin在線粒體自噬中的作用[37]。

研究表明，癌細(xì)胞中E3泛素連接酶ARIH1/HHARI可誘導(dǎo)PINK1依賴性的線粒體自噬發(fā)生，這一過程不依賴parkin[38]。最近磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，Rab8A、Rab8B及Rab13是PINK1的間接基質(zhì)，可作為PINK1活性的生物標(biāo)記，對監(jiān)測線粒體自噬發(fā)生有重要作用，且這一過程不需parkin參與[39]。以上研究表明，PINK1可介導(dǎo)parkin非依賴性的線粒體自噬。Youle等[40]研究證實(shí)，敲除parkin后，PINK1可通過磷酸化泛素蛋白，將OPTN和NDP52募集至線粒體，然后OPTN和NDP52將ULK1、DFCP1 和WIPI1募集至鄰近線粒體的位置，進(jìn)而與LC3相互作用，誘導(dǎo)低水平線粒體自噬。這表明PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬可不依賴parkin，但parkin的存在會(huì)放大PINK1誘導(dǎo)的信號(hào)通路，增強(qiáng)線粒體自噬過程[40]。

4 結(jié)語

PINK1可通過募集并活化parkin引發(fā)線粒體自噬；parkin敲除后，PINK1也可通過泛素蛋白磷酸化募集OPTN和NDP52至線粒體，進(jìn)而誘導(dǎo)低水平線粒體自噬。PINK1是線粒體自噬發(fā)生的主要因子，還可作為衡量線粒體是否損傷的探測器。但線粒體損傷特異性上調(diào)PINK1基因表達(dá)的通路仍需進(jìn)一步研究。

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