朱逸敏，張文宏

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院,上海 200040

膿毒血癥是一種嚴(yán)重威脅生命的感染，近年來其發(fā)病率呈不斷上升之勢，且病死率居高不下[1-2]。診斷膿毒血癥后盡早予以抗菌藥物是治療成功的關(guān)鍵之一，而精準(zhǔn)、快速的病原學(xué)診斷可幫助臨床醫(yī)師及時(shí)優(yōu)化抗菌藥物的使用。目前，基于培養(yǎng)的病原學(xué)診斷方法(如血培養(yǎng)、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜等)仍是膿毒血癥病原學(xué)診斷的主要手段[3-4]，但有不可忽視的缺點(diǎn)，如培養(yǎng)時(shí)間較長，需數(shù)天才能鑒定； 無法檢測苛養(yǎng)菌、胞內(nèi)菌、病毒等無法常規(guī)培養(yǎng)的病原體。為解決以上問題，近年來出現(xiàn)了一些不依賴培養(yǎng)的病原學(xué)診斷方法。其中基于聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)的方法發(fā)展較為成熟，一批商用檢測試劑盒已入市[5]。然而，目前臨床可用的PCR方法多僅能定性檢測常見病原體，定量PCR僅局限于病毒及部分特定細(xì)菌的檢測。

近年來，二代測序技術(shù)(又稱高通量測序技術(shù))不斷成熟并普及，為病原學(xué)診斷提供了一種新的有力手段。測序過程中，直接提取標(biāo)本中的全部核酸片段并加以檢測，經(jīng)生物信息學(xué)分析即可鑒定出標(biāo)本中所含核酸的種類，并可獲得病原體的序列數(shù)、覆蓋度等定量分析數(shù)據(jù)。使用二代測序技術(shù)時(shí)，標(biāo)本在檢測前無須培養(yǎng)，避免了難以培養(yǎng)的病原體漏檢；檢測時(shí)可直接非特異性地測定全部核酸片段，無須事先選定檢測范圍(即無偏性)，最大限度地避免了漏檢，還可同時(shí)檢測宿主基因以輔助診斷；測序后可通過復(fù)查二代測序，比較治療前后的病原體序列數(shù)等定量和半定量數(shù)據(jù)，對患者進(jìn)行隨訪。

二代測序用于感染性疾病的診斷首次報(bào)道于2014年1例中樞神經(jīng)系統(tǒng)鉤體病患者[6]，此后廣泛用于多種感染性疾病的診斷。中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染研究多集中于病毒檢測，在這些報(bào)道中，二代測序在腦脊液中檢出的病毒均通過了其他方法的驗(yàn)證，結(jié)果與臨床情況吻合[7-8]。在呼吸道感染中，二代測序已用于多種呼吸道標(biāo)本檢測，包括痰、咽拭子、肺泡灌洗液等，并表現(xiàn)出良好的診斷性能[9-10]。除上述標(biāo)本，血液標(biāo)本亦為二代測序的重要應(yīng)用領(lǐng)域。本文對目前二代測序在膿毒血癥患者病原學(xué)診斷方面的研究進(jìn)行綜述。

截至2017年11月30日，以“sepsis” “bacteremia” “bloodstream infection” “next generation sequencing”及“high-throughput sequencing”為關(guān)鍵詞，在PubMed、Embase、Cochrane數(shù)據(jù)庫中檢索，獲英文文獻(xiàn)60篇；以“菌血癥”“敗血癥”“膿毒血癥”“血流感染”及“二代測序”為關(guān)鍵詞，在中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫中檢索，獲中文文獻(xiàn)6篇。經(jīng)篩選，11篇文獻(xiàn)與二代測序在膿毒血癥病原學(xué)診斷中的應(yīng)用有關(guān)，均為英文文獻(xiàn)，其中3篇與病原體核酸檢測相關(guān)[11-13]，8篇與宿主基因檢測有關(guān)[14-21]。

1 二代測序在膿毒血癥病原體檢測中的研究

1.1 研究進(jìn)展

目前已有的3項(xiàng)二代測序在膿毒血癥病原體檢測中的研究均為隊(duì)列研究。隆云等[11]在北京協(xié)和醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室(intensive care unit，ICU)開展的單中心研究納入78份膿毒血癥患者血樣。就細(xì)菌及真菌而言，最終有8份標(biāo)本培養(yǎng)及測序均陽性，3份標(biāo)本培養(yǎng)陽性而測序陰性，9份標(biāo)本培養(yǎng)陰性而測序陽性。以培養(yǎng)結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，二代測序的靈敏度及特異度分別為 72.7% 和 89.6%；采用血培養(yǎng)聯(lián)合二代測序診斷細(xì)菌或真菌感染，陽性率較單用血培養(yǎng)顯著升高(23.08% 和 12.82%，P=0.013)。此外，通過二代測序還在14份血樣中檢測到15種病毒，且均通過桑格法測序驗(yàn)證。這表明二代測序聯(lián)合血培養(yǎng)可進(jìn)一步提高病原學(xué)診斷的陽性率。值得注意的是，在3份測序假陰性標(biāo)本中，2份細(xì)菌陽性標(biāo)本(鮑曼不動桿菌及糞腸球菌)桑格法測序均為陰性，表明送檢樣本中DNA含量可能低于檢測下限；而1份真菌陽性標(biāo)本(白假絲酵母)桑格法測序陽性，提示檢測真菌等較難裂解的病原體時(shí)，二代測序存在一定的假陰性。

Grumaz等[12]進(jìn)行了一項(xiàng)基于ICU的單中心研究，共納入60例膿毒性休克患者、30例術(shù)后非感染患者及30例健康志愿者。該研究嘗試對測序結(jié)果進(jìn)行定量分析，并直觀比較二代測序與臨床情況的關(guān)聯(lián)度?；诮】等巳貉獦拥臏y序結(jié)果，他們建立了每個(gè)菌種DNA序列數(shù)在正常人群中的分布情況，進(jìn)而基于待測樣本的序列數(shù)絕對值與序列數(shù)偏離正常分布的程度，計(jì)算獲得膿毒癥指數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒血癥患者中致病菌的膿毒癥指數(shù)絕對值、豐度均顯著升高，且變化情況與臨床表現(xiàn)密切相關(guān)，一旦開始有效治療，膿毒癥指數(shù)即迅速下降。此研究不僅驗(yàn)證了二代測序用于病原學(xué)診斷的可行性，還嘗試建立了一種判別致病菌的方法，從檢測出的大量雜菌中較為可靠地鑒別出致病菌。

Gosiewski等[13]比較了健康志愿者與膿毒血癥患者的測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)健康志愿者血樣中的放線菌門豐度顯著高于膿毒血癥患者(76.3% 和 31.0%，P<0.001)，而變形菌門豐度顯著低于膿毒血癥患者(16.4% 和 60.1%，P<0.001)。健康志愿者血樣的測序結(jié)果主要為厭氧菌(76.2%)，以雙歧桿菌(73.0%)等非致病菌為主；而膿毒血癥患者血樣的測序結(jié)果以需氧菌或微量需氧菌為主(75.1%)，且大多數(shù)患者標(biāo)本中可測得有臨床意義的致病菌種。Grumaz等[12]的研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，在健康人群中，以痤瘡丙酸桿菌為主的放線菌門貢獻(xiàn)了大部分游離DNA(cell-free DNA，cfDNA)序列數(shù)。這兩項(xiàng)研究為進(jìn)一步判斷所檢出的病原體性質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

1.2 目前存在的挑戰(zhàn)

1.2.1污染和致病菌的判讀目前，所有二代測序研究均顯示可在健康人血樣中檢出多種微生物的序列，膿毒血癥患者亦如此，因此判斷所檢出的微生物為致病菌還是污染菌顯得尤為重要。cfDNA定量分析是二代測序的特點(diǎn)之一，測得的DNA序列數(shù)、覆蓋度、相對豐度等信息在判斷病原體性質(zhì)方面可能有一定幫助。

Grumaz等[12]提出的膿毒癥指數(shù)綜合了序列數(shù)絕對值及其偏離正常的程度并以此進(jìn)行判斷，可明顯放大序列數(shù)的異常程度。當(dāng)病原體的序列數(shù)接近判斷閾值時(shí)，用膿毒癥指數(shù)比直接基于序列數(shù)進(jìn)行結(jié)果判斷更為可靠。雖然其研究樣本量較小，且未經(jīng)其他研究驗(yàn)證，但仍值得參考。

隆云等[11]則從測序覆蓋度、序列數(shù)、臨床醫(yī)師意見3個(gè)方面進(jìn)行判斷，病原體需滿足3點(diǎn)方認(rèn)為是致病菌：其測序覆蓋度需位列全部檢出病原體的前十；其序列數(shù)需>3且大于正常上限(正常上限為健康志愿者中該病原體序列數(shù)的第三四分位數(shù)+3倍四分位距)；符合臨床醫(yī)師根據(jù)臨床癥狀得出的判斷。然而，這種判斷方法存在一定問題：測序覆蓋度與病原體基因組大小有關(guān)，病毒的測序覆蓋度常遠(yuǎn)高于細(xì)菌、真菌及寄生蟲，可能導(dǎo)致有意義的病原體被遺漏；此外，真菌、分枝桿菌等部分有臨床意義的病原體可能因?yàn)槠浒谳^厚，DNA難以釋放入血，導(dǎo)致其測得的序列數(shù)較低，覆蓋度亦較低。

二代測序可在血液中檢測出大量非致病微生物序列，對測序結(jié)果的判讀常需結(jié)合臨床綜合判斷。現(xiàn)有研究尚未給出單純基于測序結(jié)果判斷污染菌或致病菌的標(biāo)準(zhǔn)，二代測序的定量分析優(yōu)勢尚未發(fā)揮，有待進(jìn)一步研究。

1.2.2抗微生物治療對測序結(jié)果的影響理論上，死菌釋放的DNA也可被測出，因此二代測序?qū)垢腥局委熀蟮幕颊咴\斷靈敏度應(yīng)較高。然而，cfDNA的半衰期短至數(shù)分鐘，使病原體序列數(shù)與病情變化高度相關(guān)，測序結(jié)果極易受治療的影響。Grumaz等[12]研究顯示，治療后數(shù)日內(nèi)膿毒癥指數(shù)即顯著下降，提示抗微生物治療對測序結(jié)果有巨大影響：在接受經(jīng)驗(yàn)性治療后的患者中，也許應(yīng)采取更為寬松的病原體判讀標(biāo)準(zhǔn)以提高陽性率。此外，序列數(shù)與病情變化的相關(guān)性也揭示了一種可能，即序列數(shù)顯著下降或消失是否可用于抗感染藥物療程的優(yōu)化。關(guān)于這些問題，尚待有力的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持。

1.2.3病原體耐藥基因檢測二代測序具有非特異性的特點(diǎn)，理論上可檢測包括耐藥基因在內(nèi)的全部核酸序列。Grumaz 等的研究驗(yàn)證了二代測序檢測耐藥基因的可行性[12]。但目前研究中細(xì)菌、真菌測序的覆蓋率仍較低，常僅能滿足種屬鑒定的需要，不能有效覆蓋耐藥基因的檢測。因此，在二代測序獲得病原體鑒定結(jié)果后，臨床醫(yī)師有時(shí)仍需根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選用藥物。這一缺陷可能與血液中病原體核酸含量遠(yuǎn)低于宿主核酸含量，且cfDNA半衰期較短有關(guān)[22]。目前，二代測序在膿毒血癥診斷方面的研究仍集中于病原體鑒定，在耐藥性檢測方面尚缺乏較為系統(tǒng)的研究。

2 二代測序在宿主核酸檢測中的研究

在感染性疾病中宿主與病原體同等重要。膿毒血癥患者血樣中仍有90%以上的cfDNA來自宿 主[11-12,14-15]，檢測宿主DNA及微小RNA(microRNA，miRNA)在膿毒血癥診斷中可能有一定作用。無偏性的特點(diǎn)還可使二代測序在檢測病原體核酸的同時(shí)對宿主DNA及miRNA進(jìn)行檢測。

2.1 cfDNA在膿毒血癥與非感染性疾病中的鑒別診斷價(jià)值

3項(xiàng)研究通過二代測序發(fā)現(xiàn)，膿毒血癥患者血樣中總cfDNA序列數(shù)與健康志愿者相比有上升趨勢[14-16]，但在術(shù)后無感染患者中cfDNA序列數(shù)亦呈上升趨勢[11]。此外，在腫瘤[23]、創(chuàng)傷[24]、卒中[25]等患者中，cfDNA含量亦可升高。對cfDNA進(jìn)行電泳后，均呈凋亡相關(guān)的片段長度模式[26-27]，表明膿毒血癥患者中cfDNA含量增加可能來自非特異性的組織破壞，而不是感染所致的特異性病理生理學(xué)變化，因此二代測序用于膿毒血癥診斷價(jià)值有限。另一方面，研究發(fā)現(xiàn)在膿毒血癥患者中，雖然宿主cfDNA占總cfDNA的比例有所下降，但這一趨勢源于病原體DNA含量增高[11-12]，此時(shí)常可直接根據(jù)病原體DNA測序結(jié)果進(jìn)行判讀。因此，宿主來源cfDNA含量的變化趨勢在鑒別感染性因素中意義有限。

2.2 miRNA在膿毒血癥中的鑒別診斷價(jià)值

病原體與宿主的相互作用可導(dǎo)致宿主基因調(diào)控、表達(dá)等發(fā)生變化。miRNA作為重要一環(huán)，對其進(jìn)行測序可能有助于膿毒血癥的病原學(xué)診斷?，F(xiàn)有的4項(xiàng)研究均基于膿毒血癥患者與非感染性炎癥反應(yīng)綜合征患者的對比，篩選出大量膿毒血癥患者中表達(dá)水平有變化的miRNA[17-20]。此外，Reithmair等[20]的研究更揭示了血液中miRNA水平的空間特異性。與健康人相比，膿毒血癥患者在血清、外泌體和血細(xì)胞3個(gè)不同空間中共發(fā)現(xiàn)77個(gè)下調(diào)miRNA及103個(gè)上調(diào)miRNA，主要為血細(xì)胞來源的miRNA(62.14% 上調(diào)miRNA，64.94% 下調(diào)miRNA)；僅 2.91% 的上調(diào)miRNA及 3.90% 的下調(diào)miRNA在3個(gè)空間中的變化趨勢一致。

除鑒別非感染性因素外，miRNA水平變化還可幫助判斷可能的病原體種類。Dix等[21]比較了白假絲酵母感染、曲霉感染、脂多糖處理后血清中樹突細(xì)胞的miRNA表達(dá)水平變化，篩選到一些miRNA的表達(dá)差異，并可追溯至相應(yīng)基因水平。這為解讀測序結(jié)果，幫助判斷可能病原體提供了一定的幫助。

在血液膿毒血癥病因鑒別方面miRNA測序已展示出一定潛力，miRNA水平變化也許能幫助判讀病原體DNA的測序結(jié)果。但目前研究尚處于探索階段，多為膿毒血癥患者與大型手術(shù)后全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)患者的病例-對照研究，且樣本量較小；其篩選獲得的miRNA尚缺少隊(duì)列研究的驗(yàn)證，且在中國人群中尚未進(jìn)行驗(yàn)證。

3 結(jié)語

在膿毒血癥診斷中，二代測序技術(shù)顯示了獨(dú)特優(yōu)勢，其快速、無偏的特性較好地補(bǔ)充了傳統(tǒng)病原學(xué)診斷方法的不足，有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。然而，二代測序尚存在缺乏公認(rèn)的判讀標(biāo)準(zhǔn)、測序結(jié)果與治療關(guān)系不明確、耐藥基因難以檢測等不足之處，亦缺乏與傳統(tǒng)診斷方法較大規(guī)模的比較驗(yàn)證。隨著相關(guān)研究的完善，二代測序在膿毒血癥診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值將得到進(jìn)一步提升。

除對病原體基因進(jìn)行測序外，對膿毒血癥患者miRNA進(jìn)行測序已顯示出一定的診斷價(jià)值。目前已篩選出一系列潛在的可用于鑒別非感染性炎癥反應(yīng)或病原體種類的miRNA，且發(fā)現(xiàn)miRNA水平在空間分布上的差異。但多為膿毒血癥患者與手術(shù)后患者的病例-對照研究，篩選出的miRNA尚未在中國人群中進(jìn)行較好驗(yàn)證。因此，其診斷性能有待更高級別的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持。

此外，檢測價(jià)格亦是限制二代測序技術(shù)推廣的重要因素，但近年來測序成本快速下降。全基因組測序在2001年需耗費(fèi)100萬美元；在二代測序技術(shù)的幫助下，2011年降至1萬美元。在國產(chǎn)測序技術(shù)的推動下，2017年病原體二代測序的成本降至每份標(biāo)本 3 000 元人民幣左右。因此，有理由相信，未來幾年中采用二代測序檢測病原體的成本將很快逼近甚至低于血培養(yǎng)，從而大大推動其臨床應(yīng)用。

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