單奇，劉書貴，馬麗莎，李麗春，鄭光明

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部休閑漁業(yè)重點實驗室，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(廣州)，廣東 廣州 510380)

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)為弧菌科氣單孢菌屬，該菌廣泛分布于淡水、咸水、河水和海水中[1]，從健康或患病水產(chǎn)動物體內(nèi)均能分離得到，可引起多種淡水魚類發(fā)生爛鰓病、爛尾病、流行性潰瘍綜合征和細(xì)菌性敗血癥等[2-3]。近年來該菌引起疾病更是呈爆發(fā)趨勢，由嗜水氣單胞菌引起的混合感染已成為鯉科魚類養(yǎng)殖的主要病害[4]。

氟苯尼考(florfenicol)為動物專用第3代氯霉素類廣譜抗菌藥物，與氯霉素和甲砜霉素相比，因其具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)和副作用小等特點[5]，被廣泛用于水產(chǎn)病害防治。氟苯尼考對大多數(shù)魚類病原菌都具有較強(qiáng)的抗菌活性，包括嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌、發(fā)光桿菌、愛德華氏菌、遲緩愛德華氏菌、鰻弧菌等[6]。歐洲、挪威、加拿大、日本、中國、韓國均已批準(zhǔn)氟苯尼考用于各種水產(chǎn)動物[7]。然而，隨著氟苯尼考在水產(chǎn)動物細(xì)菌性疾病治療上的廣泛使用甚至濫用，多種魚類病原菌已經(jīng)出現(xiàn)了耐藥性，如嗜水氣單胞菌[8]、維氏氣單胞菌[9]、肺炎克雷伯氏菌[10]、沙門氏菌[11]等。很多學(xué)者倡導(dǎo)通過優(yōu)化給藥方案來減少耐藥菌株的產(chǎn)生、傳播和擴(kuò)散。

防突變濃度(MPC)是指防止步耐藥突變菌株選擇性富集擴(kuò)增所需的最低藥物濃度[12]。最低抑菌濃度(MIC)和防突變濃度(MPC)之間的藥物濃度范圍稱為突變選擇窗(MSW)[13]。防突變濃度(MPC)理論認(rèn)為血藥濃度始終高于MPC，不僅可以發(fā)揮好的療效，也會防止菌株發(fā)生耐藥突變；血藥濃度始終處于MIC以下，雖不能產(chǎn)生預(yù)期療效，但低水平藥物濃度壓力下，菌株發(fā)生耐藥的幾率也很低；相反，血藥濃度在整個給藥間隔或較長時間處于突變選擇窗內(nèi)，即使臨床治療成功，菌株發(fā)生耐藥突變的機(jī)率也加大[12-13]。因此，在獸醫(yī)臨床用藥時，將血藥濃度維持在MPC以上，不僅可以達(dá)到最佳療效，也可以減少耐藥菌株的產(chǎn)生。本實驗擬通過測定氟苯尼考對多株嗜水氣單胞菌的MIC和MPC，為水產(chǎn)臨床優(yōu)化氟苯尼考的給藥方案、減少耐藥菌株的產(chǎn)生提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥品

氟苯尼考對照品(含量99%)，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；氟苯尼考原料藥(含量98%)，珠江水產(chǎn)研究所藥廠惠贈。

1.1.2 菌株與培養(yǎng)基

受試菌41株，其中嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC7966由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所魚病研究室提供，40株嗜水氣單胞菌(表1)于2015—2016年分離自廣東省佛山、中山和肇慶等重點養(yǎng)殖區(qū)域患病的水生動物。Mueller-Hinton(MH)瓊脂、MH肉湯均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

表1 菌株來源與背景Tab.1 Source and background of the Aeromonashy drophilia strains

1.2 實驗方法

1.2.1 MIC和MIC99的測定

采用瓊脂平板二倍稀釋法測定氟苯尼考對嗜水氣單胞菌的MIC，MH瓊脂平板所含藥物的質(zhì)量濃度范圍為0.031～128 μg/mL，將處于對數(shù)生長期的菌懸液，用新鮮的MH肉湯稀釋調(diào)整到1×105CFU/mL，每個平板接種100 μL(最終接種量約為1×104CFU)，28℃培養(yǎng)24 h后，按美國國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)2010年頒布的無細(xì)菌生長的最低藥物濃度判定為MIC。

在測得的MIC的基礎(chǔ)上，依次遞減20%至1/2MIC藥物濃度，制成含不同藥物濃度的瓊脂平板。將處于對數(shù)生長期的菌落溶于無菌生理鹽水中, 調(diào)整濃度至3×107CFU/mL，再經(jīng)無菌生理鹽水10倍倍比稀釋至3×102CFU/mL。將不同稀釋倍數(shù)的菌液各取100 μL接種于平板上，使每個藥物濃度平板上的含菌量分別為3×106、 3×105、 3×104、 3×103、 3×102CFU。28 ℃培養(yǎng)24 h后，挑選合適的平板計數(shù)，按照崔俊昌等[14]報道的方法計算MIC99(抑制99%細(xì)菌生長的最低抑菌濃度)。

1.2.2 MPCpr和MPC的測定

從長有嗜水氣單胞菌的瓊脂平板上挑取3個菌落接種于10 mL新鮮的MH肉湯中，28 ℃恒溫?fù)u床上過夜培養(yǎng)，3 500 r/min離心20 min后，將富集后的細(xì)菌再懸浮在100 mL新鮮的 MH肉湯中，28 ℃恒溫?fù)u床上培養(yǎng)6 h，將全部菌液經(jīng)3 500 r/min離心20 min后富集，用無菌生理鹽水將菌液濃度稀釋到3×1010CFU/mL。

在測得的MIC基礎(chǔ)上，制得系列藥物濃度為1、2、 4、 8、 16、 32和64 MIC的MH瓊脂平板，每個藥物濃度各設(shè)4個平行，每個平板接種100 μL菌懸液，最終嗜水氣單胞菌接種量為1.2×1010CFU。接種后的平板放置在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 h。以72 h 后孵育不出菌落的最低藥物濃度設(shè)為暫定防突變濃度(MPCpr)。然后在測得的MPCpr的基礎(chǔ)上，依次遞減(20%)藥物濃度，制備含藥平板，沒有出現(xiàn)菌落生長的最低藥物濃度即為MPC。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件內(nèi)嵌的probit回歸模型對氟苯尼考藥效學(xué)數(shù)據(jù)(MIC和MPC)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算氟苯尼考對多株嗜水氣單胞菌的MIC50、MIC90和MPC90。

2 結(jié)果

2.1 氟苯尼考對嗜水氣單胞菌ATCC7966的MIC、MIC99和MPC

采用瓊脂稀釋法測定，氟苯尼考對嗜水氣單胞菌ATCC7966的MIC為1.0 μg/mL、MIC99為0.8 μg/mL，MPC為4.8 μg/mL，MSW(MIC99～MPC)為0.8～4.8 μg/mL、SI(MPC/MIC99)為6。

2.2 氟苯尼考對嗜水氣單胞菌臨床分離株的MIC50、MIC90和MPC90

氟苯尼考對40株臨床分離的嗜水氣單胞菌的MIC和MPC見表2。由表2中可知，氟苯尼考對40株嗜水氣單胞菌的MIC范圍為0.5～4.0 μg/mL，基于SPSS Probit模型計算所得MIC50和MIC90分別為1.0和2.0 μg/mL；氟苯尼考對40株嗜水氣單胞菌的MPC為3.2～25.6 μg/mL，基于SPSS Probit模型計算所得MPC50和MPC90分別為6.4和16.0 μg/mL，MSW(MIC90～MPC90)和SI(MPC90/MIC90)分別為2.0～16.0 μg/mL和8。

表2 氟苯尼考對40株嗜水氣單胞菌臨床株的最低抑菌濃度(MIC)和防突變濃度(MPC)Tab.2 MIC and MPC of florfenicol against 40 isolates of Aeromonashy drophilia

3 討論

抗菌藥物的大量使用，特別是毫無節(jié)制的不合理使用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性日趨嚴(yán)重。然而新藥研發(fā)費用巨大且周期很長，因此充分利用現(xiàn)有藥物，并利用藥動學(xué)和藥效學(xué)理論來制定合理的給藥方案是防止和控制耐藥性產(chǎn)生的有效辦法。傳統(tǒng)生產(chǎn)中，抗菌藥物的使用以治愈疾病而非阻止耐藥為目標(biāo)，藥效學(xué)參數(shù)主要以MIC為指導(dǎo)，其著眼點是通過抗菌藥物殺死或抑制敏感細(xì)菌，依賴宿主防御系統(tǒng)清除突變菌，從而達(dá)到控制感染，減少嚴(yán)重不良反應(yīng)的目的，但大量反復(fù)使用抗菌藥物所產(chǎn)生的選擇壓力，使細(xì)菌中的突變亞群逐漸發(fā)展成為優(yōu)勢菌群，導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)生不同水平的耐藥性。這就迫切需要尋找新的治療策略，在控制感染的同時，防止細(xì)菌耐藥性的進(jìn)一步發(fā)展。美國學(xué)者Zhao及其團(tuán)隊[15-16]于1999年首先提出了關(guān)于細(xì)菌MPC和MSW的理論，將MPC作為評價抗菌藥物新的藥效學(xué)指標(biāo)，為臨床優(yōu)化抗菌藥物給藥方案，限制耐藥突變體選擇性擴(kuò)增提供了新思路，也對新藥的開發(fā)提出了新要求。MPC與MSW治療策略既要控制感染，又要防止耐藥。選擇MPC低、MSW窄的藥物，調(diào)整劑量和給藥方案，聯(lián)合用藥，規(guī)律用藥，有助于關(guān)閉或縮小MSW，減少耐藥突變菌選擇性富集擴(kuò)增的機(jī)率，達(dá)到防止細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的目的。本實驗測定了氟苯尼考對嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC7966和40樣臨床分離菌的MIC和MPC，為臨床合理用藥提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

本實驗測得氟苯尼考對嗜水氣單胞菌ATCC7966的MIC為1.0 μg/mL。而吳雅麗等[17]報道恩諾沙星、多西環(huán)素和甲氧芐啶對嗜水氣單胞菌ATCC7966的MIC分別為0.002、 0.125和2.000 μg/mL。Libisch等[18]報道環(huán)丙沙星、慶大霉素、四環(huán)素對嗜水氣單胞菌ATCC7966的MIC分別為<0.5、 2.0和0.5 μg/mL。表明恩諾沙星、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星和四環(huán)素對嗜水氣單胞菌ATCC7966的抗菌活性可能優(yōu)于氟苯尼考，而甲氧芐啶和慶大霉素對嗜水氣單胞菌ATCC7966的抗菌活性可能不如氟苯尼考。

本實驗中氟苯尼考對40株嗜水氣單胞菌分離菌的MIC為0.5～4.0 μg/mL，MPC為3.2～25.6 μg/mL，SI為4.8～12.8。李夢影等[19]測得氟苯尼考對 1株嗜水氣單胞菌的MIC為0.5 μg/mL，MPC為6.0 μg/mL，SI為12，這些參數(shù)數(shù)值均在本實驗測定的相應(yīng)參數(shù)數(shù)值的范圍之內(nèi)，說明本實驗選取菌株數(shù)量較多，所得數(shù)據(jù)具有一定程度的代表性。然而俞觀泉等[20]測得氟苯尼考對5株嗜水氣單胞菌的MIC為8.0～19.2 μg/mL，MPC均大于128 μg/mL，這些數(shù)值與本實驗數(shù)據(jù)相比存在著較大差異，這可能是所用菌株本身MIC值較高所致。SI為選擇指數(shù)，是MPC與MIC的比值，用于比較抗菌藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥突變株的能力，選擇指數(shù)越小，MSW窗口越窄，篩選出耐藥菌株的機(jī)會就越小；反之，選擇指數(shù)越大，MSW窗口越寬，產(chǎn)生耐藥菌株的機(jī)會就越大。本實驗不同臨床分離株選擇指數(shù)差異較大，這可能與不同菌株發(fā)生耐藥突變的基因不同有關(guān)。MIC范圍為0.5～4.0 μg/mL，MIC50和MIC90分別為1.0和2.0 μg/mL；MPC為3.2～25.6 μg/mL，MPC50和MPC90分別為6.4和16.0 μg/mL。

李夢影等[19]報道鯽口服10 mg/kg氟苯尼考，血漿中氟苯尼考達(dá)峰時間為4.0 h，峰濃度為7.80 μg/mL，消除半衰期為92.11 h。根據(jù)2010年版《獸藥使用指南(化學(xué)藥品)》對于各種水產(chǎn)動物，氟苯尼考口服給藥推薦劑量為10 mg/kg(以氟苯尼考計)。國內(nèi)批準(zhǔn)上市的水產(chǎn)用氟苯尼考粉說明書上的推薦劑量為：“以氟苯尼考計，每1 kg體重魚、蝦、蟹拌餌投喂10～15 mg”。據(jù)文獻(xiàn)報道，水產(chǎn)動物口服10～15 mg/kg 氟苯尼考，血藥濃度達(dá)峰時間一般為3～12 h，峰濃度在2.37～7.80 μg/mL之間[19，21-23]。此時氟苯尼考血藥濃度雖遠(yuǎn)在MIC90之上，但是卻顯著低于MPC90(16.0 μg/mL)，落在了MSW內(nèi)，菌株發(fā)生耐藥突變的機(jī)率加大。因此，按照氟苯尼考推薦給藥方案，容易出現(xiàn)細(xì)菌耐藥性。研究表明氟苯尼考為濃度依賴性藥物，其殺菌作用和臨床療效隨著血藥濃度的增加而增加[24]。本實驗得到的MPC90高達(dá)16.0 μg/mL，而氟苯尼考在鯽和草魚體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)研究表明，即使增加給藥劑量到30 mg/kg，也無法使血藥濃度處于MPC90以上[19]。加大給藥劑量使血藥濃度始終處于MPC90之上，這樣既可以清除細(xì)菌，又能避免出現(xiàn)耐藥菌株。但是因為藥物毒副作用和藥物殘留問題，臨床用藥時不能隨意提高給藥劑量，因此該法難以在臨床上推廣。有研究表明，聯(lián)合用藥可以縮小或關(guān)閉病原菌的突變選擇窗，氟苯尼考聯(lián)合多西環(huán)素使氟本尼考對3株大腸桿菌的MPC分別由原來的256.0、 128.0、 460.8 μg/mL，變?yōu)?.0、 8.0、 16.0 μg/mL，均關(guān)閉了MSW，有效抑制了耐藥突變菌株的產(chǎn)生[25]。盧靜等[26]報道在聯(lián)合藥敏試驗中，沒食子酸或槲皮素與氟苯尼考聯(lián)合用藥對嗜水氣單胞菌具有協(xié)同作用，有助于降低抗生素的用量及殘留。理論上，通過聯(lián)合用藥，耐藥菌株的產(chǎn)生必須同時對兩種藥物發(fā)生耐藥突變，發(fā)生的概率約為10-14～10-18，因此不易產(chǎn)生耐藥性[27]。以上研究表明，單純使用氟苯尼考易導(dǎo)致嗜水氣單胞菌產(chǎn)生耐藥性，或許將氟苯尼考與其他抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用，是縮小甚至關(guān)閉耐藥突變選擇窗的最佳選擇。因此，下一步仍需繼續(xù)研究氟苯尼考和其他抗菌藥物合用對嗜水氣單胞菌耐藥突變的影響，并結(jié)合藥動學(xué)數(shù)據(jù)，探索制定氟苯尼考在水產(chǎn)養(yǎng)殖中合理使用的具體方案，以更好地服務(wù)實際生產(chǎn)。

[1] Rahman M M, Somsiri T, Tajima K, et al. Distribution ofAeromonassp. emphasizing on a newly identified species ofAeromonassp. T8 isolated from fish and aquatic animals in Southeast Asia[J]. Pak J Biol Sci, 2004, 7(2): 258-268.

[2] 吳學(xué)祥，溫貴蘭，文明，等. 大鯢致病性嗜水氣單胞菌的分離鑒定與耐藥性分析[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2014, 4(7): 108-110.

[3] Vivas J F, Carracedo B, Riano J, et al. Behavior of anAeromonashydrophilaaroA live vaccine in water microcosms[J].Appl Environ Microb, 2004, 70(5): 2702-2708.

[4] Guz L, Kozinska A. Antibiotic susceptibility ofAeromonashydrophilaandA.sobriaisolated from farmed carp (CyprinuscarpioL.)[J]. Bull Vet Inst Pulawy, 2004, 48: 391-395.

[5] 賀利民，曾振靈，黃顯會，等. 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定豬肉組織中氟苯尼考?xì)埩鬧J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2005, 26(3): 100-102.

[6] Mcginnis A, Gaunt P, Santucci T, et al. In vitro evaluation of the susceptibility ofEdwardsiellaictaluri, etiological agent of enteric septicemia in channel catfish,Ictaluruspunctatus(Rafinesque), to florfenicol[J]. J Vet Diagn Invest, 2003, 15(6): 576-579.

[7] Gaunt P, Endris R, Khoo L, et al. Preliminary assessment of the tolerance and efficacy of florfenicol againstEdwardsiellaictaluriadministered in feed to channel catfish[J]. J Aquat Anim Health, 2003, 15(3): 239-247.

[8] 張文文. 常用漁藥有效含量、殺菌效果比較及抗生素耐藥性初步研究[D].舟山: 浙江海洋學(xué)院, 2014.

[9] 耿昕穎，葛錚，孔令聰，等. 52 株不同淡水魚類維氏氣單胞菌耐藥表型的分析[J]. 中國獸藥雜志, 2015, 49(6): 1-5.

[10] 曹穎穎，杜泓明，白安斌，等. 家養(yǎng)觀賞地圖魚肺炎克雷伯氏菌, 維氏氣單胞菌與黏質(zhì)沙雷氏菌的分離鑒定及耐藥性分析[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2015, 42(1): 215-223.

[11] 叢莉. 魚塘生態(tài)體系沙門氏菌的耐藥性及耐藥基因分析[D].廣州: 暨南大學(xué), 2011.

[12] Drlica K, Zhao X. Mutant selection window hypothesis updated[J]. Clin Infect Dis, 2007, 44(5): 681-688.

[13] Xilin Z, Drlica K. Restricting the selection of antibiotic-resistant mutant bacteria: measurement and potential use of the mutant selection window[J]. J Infect Dis, 2002, 185(4): 561-565.

[14] 崔俊昌，劉又寧，王睿，等. 4 種氟喹諾酮類藥物對金黃色葡萄球菌的防耐藥變異濃度[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2004, 84(22): 1863-1866.

[15] Dong Y, Zhao X, Domagala J, et al. Effect of fluoroquinolone concentration on selection of resistant mutants ofMycobacteriumbovisBCG andStaphylococcusaureus[J]. Antimicrob Agents Ch, 1999, 43(7): 1756-1758.

[16] Zhao X, Drlica K. Restricting the selection of antibiotic-resistant mutants: a general strategy derived from fluoroquinolone studies[J]. Clin Infect Dis, 2001, 33(Supplement 3): S147-S156.

[17] 吳雅麗，鄧玉婷，姜蘭，等. 廣東省水產(chǎn)動物源氣單胞菌對抗菌藥物的耐藥分析[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報, 2013, 22(2): 219-224.

[18] Libisch B, Giske C G, Kovács B, et al. Identification of the first VIM metallo-β-lactamase-producing multiresistantAeromonashydrophilastrain[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(5): 1878-1880.

[19] 李夢影，徐麗娟，呂利群. 氟苯尼考在鯽和草魚體內(nèi)的藥代/藥效動力學(xué)聯(lián)合參數(shù)及其臨床給藥方案的研究[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2014, 38(6): 888-895.

[20] 俞觀泉, 盧彤巖, 楊雨輝. 幾種抗茵藥物對嗜水氣單胞菌突變選擇窗 (MSW) 范圍的研究[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 2012, 48(12): 73-75.

[21] Gaunt P S, Langston C, Wrzesinski C, et al. Single intravenous and oral dose pharmacokinetics of florfenicol in the channel catfish (Ictaluruspunctatus)[J]. J Vet Pharmacol Ther, 2012, 35(5): 503-507.

[22] 王瑞雪. 氟苯尼考在西伯利亞鱘的體內(nèi)外藥效學(xué)及藥動學(xué)研究[D]. 哈爾濱: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[23] 王偉利，羅理，姜蘭，等. 適溫條件下氟苯尼考在羅非魚體內(nèi)的藥物動力學(xué)[J]. 大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報, 2010, 25(4): 285-288.

[24] Sidhu P, Rassouli A, Illambas J, et al. Pharmacokinetic-pharmacodynamic integration and modelling of florfenicol in calves[J]. J Vet Pharmacol Ther, 2014, 37(3): 231-242.

[25] 陳陽陽，薛慧亮，馬紅霞，等. 氟苯尼考聯(lián)合多西環(huán)素縮小豬源大腸桿菌耐藥突變選擇窗[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報, 2013, 33(11): 1720-1723.

[26] 盧靜,王振寧,陳銳,等.幾種中藥單體和抗生素對嗜水氣單胞菌及溫和氣單胞菌的體外抑菌活性研究[J].水生生物學(xué)報, 2013, 37(6)：1128-1132.

[27] 肖永紅.細(xì)菌耐藥防突變濃度與抗菌藥的合理應(yīng)用[J].中國醫(yī)學(xué)論壇報, 2007, 33(24): 20-20.