牛曰華，張?zhí)炻?，鄒紅梅，朱琳，陳庚，施媛媛，費(fèi)海榕，楊云輝

(福建省海洋環(huán)境與漁業(yè)資源監(jiān)測中心， 福州350003)

大黃魚(Larimichthyscrocea)是中國重要的海水養(yǎng)殖魚類和出口創(chuàng)匯水產(chǎn)品。福建沿海是大黃魚最主要的養(yǎng)殖區(qū)域。2016年福建省大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)量為1.465×105t，占中國大黃魚養(yǎng)殖總產(chǎn)量的 88.53%[1]。

恩諾沙星(enrofloxacin)是人工合成的第3代喹諾酮類(quinolones)藥物，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛使用，主要用來治療細(xì)菌性疾病，具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)以及與其他抗生素?zé)o交叉耐藥性等特點(diǎn)[2]，其在動(dòng)物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物為環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)。環(huán)丙沙星同樣也具有較強(qiáng)的抗菌活性。但此類藥物容易引起細(xì)菌的耐藥性，從而對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境帶來損害[3]，因此中國農(nóng)業(yè)部制定了恩諾沙星殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星總殘留量在水產(chǎn)動(dòng)物肌肉中不得超過100 μg/kg[4]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，若不合理使用恩諾沙星，往往會(huì)造成藥物殘留超標(biāo)，而藥物在動(dòng)物體內(nèi)的代謝過程和消除規(guī)律則是制定用藥方案和休藥期的理論基礎(chǔ)，因此開展恩諾沙星在水產(chǎn)動(dòng)物中的代謝動(dòng)力學(xué)和殘留消除研究，對(duì)促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展和保障廣大消費(fèi)者的健康具有重要意義。目前已開展恩諾沙星藥物代謝動(dòng)力學(xué)和殘留消除研究的水產(chǎn)動(dòng)物主要有大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[5-7]、日本鰻鱺(Anguillajaponica)[8]、歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)[9-10]、烏鱧(Ophicephalusargus)[11]、鱘(Acipenserschrenckii)[12]、黑裙(Sebastodesfuscescens)[13]、吉富羅非魚(JifuTilapia)[14]、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[15]、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[16]、中國對(duì)蝦(Penaeuschinensis)[14]、凡納濱對(duì)蝦(Penaeusvannamei)[17]、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)[18]、擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)[19]、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)[20]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[21-22]等，尚未見在大黃魚體內(nèi)代謝規(guī)律的研究。

本研究以大黃魚為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用肌注給藥方式，研究恩諾沙星及其主要代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在大黃魚體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和殘留消除規(guī)律，并提出休藥期建議，以期為大黃魚養(yǎng)殖過程中科學(xué)使用恩諾沙星提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用魚

健康大黃魚由福建省寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司提供，魚體重在200～300 g之間。實(shí)驗(yàn)前大黃魚在寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司養(yǎng)殖池暫養(yǎng)一周。隨機(jī)抽取5尾，進(jìn)行血漿、肌肉、肝臟和性腺等組織的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，確認(rèn)無恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留。實(shí)驗(yàn)用飼料為福建天馬科技集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)的人工配合飼料，經(jīng)檢測均不含恩諾沙星和環(huán)丙沙星。

本實(shí)驗(yàn)于2016年12月至2017年2月在福建省寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司進(jìn)行。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，大黃魚養(yǎng)殖池水溫從23 ℃逐漸降至17 ℃。實(shí)驗(yàn)期間大黃魚成活率為100%。

1.1.2 儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器包括：QTRAP 5500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(AB SCIEX公司)；Waters Acquity超高效液相色譜儀；BP211D電子天平(德國Sartorius公司)；Sigma 3-30K高速冷凍離心機(jī)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；MS3渦旋混合器(德國IKA公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)等。

1.1.3 藥品與試劑

實(shí)驗(yàn)主要試劑包括：恩諾沙星、環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，德國CNW公司)，恩諾沙星-D5、環(huán)丙沙星-D8(純度≥98%，德國Witega公司)。丁香油水門汀(上海醫(yī)療器械股份有限公司)；肝素鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙腈、乙酸銨(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Tedia公司)；無水硫酸鈉(分析純，國藥集團(tuán))。

1.2 方法

1.2.1 注射用恩諾沙星藥液的配制

精確稱取恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品5.000 g，用適量5%冰醋酸溶解，再用超純水定容至100 mL，搖勻，得到恩諾沙星溶液濃度為50 mg/mL。

1.2.2 肌注給藥和樣品采集

取20 L海水于實(shí)驗(yàn)桶中，加入1 mL丁香油水門汀，攪拌均勻，此時(shí)丁香油水門汀質(zhì)量濃度為50 mg/L。將實(shí)驗(yàn)用大黃魚放入實(shí)驗(yàn)桶中，待完全麻醉后，取出稱重，按50 mg/kg魚體重的劑量對(duì)魚背部肌肉進(jìn)行注射。分別于給藥后的5、10、15、30 min，1、2、4、8、12 h和1、2、4、5、7、9、11、13、20、30、45、60 d，采集血漿、肌肉、肝臟和性腺組織，每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)采集5尾魚。以尾靜脈采血的方式采集血漿，將采集的血漿轉(zhuǎn)移至2 mL預(yù)先用1%肝素鈉溶液處理過的離心管中，以2 348 g轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液血清為血漿樣品，儲(chǔ)存于-20 ℃保存待檢。

1.2.3 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱為Waters Acquity BEH C18柱，50 mm×2.1 mm，粒徑1.7μm；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液(含5 mmol/L乙酸銨)，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫程序見表1；流速為0.200 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量1.00 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program of the mobile phase

注：流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液(含5 mmol/L乙酸銨)；流動(dòng)相B為乙腈。

離子化模式為大氣壓噴霧電離源(ESI)，正離子模式；噴霧電壓5 500 V；氣簾氣(curtain gas)35 psi；碰撞氣(collision gas)7 psi；霧化氣(gas 1)50 psi；輔助加熱氣(gas 2)50 psi；離子源溫度500 ℃；采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描模式，選擇反應(yīng)監(jiān)測母離子、子離子、去簇電壓(DP)和碰撞能量見表2。

1.2.4 樣品處理與檢測

對(duì)于肌肉、肝臟和性腺樣品，參照農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-1-2008[23]的方法進(jìn)行檢測。對(duì)于血漿樣品，按下述方法進(jìn)行檢測：取1.00 mL血漿樣品至10 mL離心管中，準(zhǔn)確加入25 μL 1.00 mg/L內(nèi)標(biāo)溶液，然后加入5 mL 1%的甲酸-乙腈溶液(V/V)，渦旋混合1 min，再加入3 g無水硫酸鈉，再次渦旋混合1 min，以 9 391 g轉(zhuǎn)速離心5 min。殘?jiān)貜?fù)提取1次，上清液轉(zhuǎn)移至25 mL雞心瓶中，40 ℃水浴旋蒸至近干，用1 mL流動(dòng)相溶解，過0.22 μm濾膜后上機(jī)檢測。

表2 MRM模式下質(zhì)譜測定的特征離子Tab.2 Characteristic ions of mass spectrum determination in MRM mode

注：標(biāo)*為定量離子。

當(dāng)樣品中環(huán)丙沙星和恩諾沙星含量過高時(shí)，可適當(dāng)減少稱樣量，或同倍數(shù)的加大內(nèi)標(biāo)加入量和定容體積，使樣液濃度落在線性范圍內(nèi)。

1.2.5 方法的回收率和精密度

往大黃魚空白基質(zhì)(血漿、肌肉、肝臟、性腺)中添加環(huán)丙沙星和恩諾沙星混標(biāo)溶液，使其含量為2、10、100 μg/L(或 μg/kg)3個(gè)水平，每個(gè)水平6份平行。按照1.2.4的方法進(jìn)行處理，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.6 休藥期計(jì)算

恩諾沙星是按一級(jí)動(dòng)力學(xué)在體內(nèi)消除的，即在消除后期服從指數(shù)消除：C=C0e-Ket。休藥期的計(jì)算公式為：

式(1)

式(1)中，T為休藥期(h)；C0為殘留消除半對(duì)數(shù)曲線的縱截距(mg/kg)；MRL為最高殘留限量(mg/kg)；Ke為殘留消除曲線速率常數(shù)，t為給藥后某個(gè)時(shí)間點(diǎn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)采用DAS 2.0藥代動(dòng)力學(xué)軟件以及Origin 8.0、Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果

2.1 分析方法驗(yàn)證

在質(zhì)量濃度1 ～ 100 μg/L范圍內(nèi)，以恩諾沙星和環(huán)丙沙星峰面積與其內(nèi)標(biāo)物峰面積之比為縱坐標(biāo)(Y)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到恩諾沙星和環(huán)丙沙星曲線方程分別為Y=1.177 10X+0.003 62和Y=1.892 67X- 0.076 07，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99。這表明恩諾沙星和環(huán)丙沙星在1～100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。兩種藥物在血漿中的檢測限均為2 μg/L，在肌肉、肝臟和性腺中的檢測限分別為1、2、2 μg/kg。方法的回收率和精密度見表3，滿足殘留分析要求。

表3 環(huán)丙沙星和恩諾沙星在大黃魚組織中的回收率和精密度Tab.3 Recovery and precision of enrofloxacin and ciprofloxacin in Larimichthys crocea n=6

2.2 藥代動(dòng)力學(xué)

2.2.1 恩諾沙星藥代動(dòng)力學(xué)

大黃魚以50 mg/kg的劑量肌注給藥后，血漿、肌肉、肝臟和性腺中的恩諾沙星含量變化如圖1所示。給藥后，血漿中的恩諾沙星濃度呈直線上升趨勢，在給藥后10 min即達(dá)到最大質(zhì)量濃度41.5 mg/L；肌肉中恩諾沙星在給藥后30 min達(dá)到最高含量水平108 mg/kg；肝臟中恩諾沙星在給藥后1 h達(dá)到最高含量水平68.8 mg/kg；性腺中恩諾沙星在給藥后1 h達(dá)到最高含量水平22.5 mg/kg，之后開始迅速下降。

應(yīng)用DAS 2.0軟件對(duì)恩諾沙星濃度-時(shí)間關(guān)系進(jìn)行房室模型分析，結(jié)果表明，恩諾沙星在血漿、肌肉、肝臟和性腺中的代謝過程符合二室開放模型，藥物時(shí)量曲線方程分別為：C血漿=23.805e-0.639t+4.256e-0.023t，C肌肉=19.569e-0.049t+0.227e-0.01t，C肝臟=21.277e-0.097t+5.532e-0.014t，C性腺=25.051e-0.037t+0.084e-0.01t， 主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)如表4所示。

圖1 恩諾沙星在大黃魚各組織中的含量變化(a)血漿；(b)肌肉；(c)肝臟；(d)性腺。圖(a)～(d)中右上圖為給藥后0～12 h恩諾沙星在大黃魚各組織中的含量變化。Fig.1 Variation of enrofloxacin in the tissues of Larimichthys crocea during the experiment(a)plasma; (b) muscle; (c) liver; (d) gonad. The top right-hand corner of Fig. (a)-(d) mean the variation of enrofloxacin in the tissues of Larimichthys crocea during 0-12 h after intramuscular injection.

2.2.2 環(huán)丙沙星藥代動(dòng)力學(xué)

環(huán)丙沙星為恩諾沙星主要代謝產(chǎn)物。恩諾沙星肌注給藥后，環(huán)丙沙星在血漿、肌肉、肝臟和性腺中的含量變化如圖2所示。給藥后5 min，在肝臟、血漿、肌肉組織中即檢測到環(huán)丙沙星，之后環(huán)丙沙星含量呈上升趨勢，直至到達(dá)最大值，其中肝臟和血漿中的環(huán)丙沙星含量上升迅速，性腺和肌肉中的環(huán)丙沙星含量上升速率較肝臟和血漿中慢。在肝臟中，環(huán)丙沙星含量具有明顯的雙峰現(xiàn)象，在給藥后1 h達(dá)到最大峰值3.96 mg/kg，在給藥后4 h形成第二個(gè)峰值2.18 mg/kg。血漿中的環(huán)丙沙星在給藥后1 h質(zhì)量濃度達(dá)到最大值0.693 mg/L。肌肉和性腺中的環(huán)丙沙星均在給藥后24 h達(dá)到最大值，含量分別為0.579 mg/kg和1.11 mg/kg。

應(yīng)用DAS 2.0軟件對(duì)環(huán)丙沙星濃度-時(shí)間關(guān)系進(jìn)行房室模型分析，結(jié)果表明，環(huán)丙沙星在血漿、肌肉、肝臟和性腺中的代謝過程不符合一室和二室模型。

表4 恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.4 Pharmacokinetic parameters of enrofloxacin in Larimichthys crocea

圖2 環(huán)丙沙星在大黃魚各組織中的含量變化(a)血漿；(b)肌肉；(c)肝臟；(d)性腺。圖(a)～(d)中右上圖為給藥后0 ～ 24 h環(huán)丙沙星在大黃魚各組織中的含量變化。Fig.2 Variation of ciprofloxacin in the tissues of Larimichthys crocea during the experiment(a)plasma; (b) muscle; (c) liver; (d) gonad. The top right-hand corner of Fig. (a)-(d) mean the variation of ciprofloxacin in the tissues of Larimichthys crocea during 0-24 h after intramuscular injection.

2.3 殘留消除規(guī)律

恩諾沙星含量在大黃魚體內(nèi)達(dá)到最大值后，在給藥后的前48小時(shí)下降明顯，血漿中的恩諾沙星質(zhì)量濃度從最高的41.5 mg/L降至2.32 mg/L；肌肉、肝臟、性腺中的恩諾沙星含量分別從最高的108、 68.8、 22.5 mg/kg降至8.25、 5.18、 4.53 mg/kg，之后藥物濃度保持穩(wěn)定下降，但消除速度明顯變慢，一直到給藥后的第60天，恩諾沙星在血漿、肌肉、肝臟和性腺中均可檢出，濃度分別為5.58×10-3mg/L、1.62×10-2mg/kg、2.25×10-2mg/kg、3.93×10-2mg/kg。如表4所示，恩諾沙星在血漿、肌肉、肝臟和性腺中的消除半衰期分別為30.484、 51.971、 47.823、 69.315 h。

恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)僅有少部分代謝成環(huán)丙沙星，因此環(huán)丙沙星濃度較恩諾沙星低很多。血漿中的環(huán)丙沙星在給藥后1 h質(zhì)量濃度達(dá)到最大值0.693 mg/L，之后下降迅速，給藥9 d后，血漿中的環(huán)丙沙星再未檢出。環(huán)丙沙星在給藥后的前96小時(shí)，肌肉、肝臟、性腺中的環(huán)丙沙星含量下降較快，分別從最高的0.579、 3.96、 1.11 mg/kg降至8.12×10-2、 8.58×10-2、 9.76×10-2mg/kg，之后消除速率變慢。直至在給藥后的第30天，肌肉中的環(huán)丙沙星仍可檢出，含量為1.68×10-3mg/kg。

對(duì)環(huán)丙沙星在血漿、肌肉、肝臟和性腺中的藥物濃度達(dá)到最大值之后的濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行擬合，得到環(huán)丙沙星在大黃魚體內(nèi)的殘留消除曲線方程，如表5所示，其消除半衰期分別為28.88、 57.75、 43.31、 40.76 h。

表5 環(huán)丙沙星在大黃魚體內(nèi)的消除曲線方程及參數(shù)Tab.5 Elimination curve equation and parameters of Ciprofloxacin in Larimichthys crocea mg·kg-1, n=5

2.4 理論休藥期

中國農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告規(guī)定恩諾沙星在水產(chǎn)動(dòng)物肌肉中的最大殘留限量(MRL)為100 μg/kg。以肌肉作為靶組織，根據(jù)恩諾沙星在大黃魚肌肉中的藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，用Excel軟件進(jìn)行擬合，得到恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)的殘留消除曲線方程為：C=0.245 1e-0.002t，相關(guān)系數(shù)R2=0.863。通過休藥期公式計(jì)算得到休藥期為448.3 h，即18.7 d。

3 討論

3.1 恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征

本研究結(jié)果顯示，在肌注給藥方式下，恩諾沙星在大黃魚血漿中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)過程符合二室開放模型。這與恩諾沙星在大菱鲆[5]、鰻鱺[9]、鱘[12]、黑裙[13]等魚體內(nèi)的代謝模型相似。

達(dá)峰時(shí)間Tmax和峰濃度Cmax是反映藥物在體內(nèi)吸收快慢的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)條件下，大黃魚血漿、肌肉、肝臟和性腺Tmax分別為0.170、 0.500、 1.000、 1.000 h，Cmax分別為41.500 mg/L、 107.800 mg/kg、 68.835 mg/kg、 22.458 mg/kg。這說明恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)吸收較快，其中在血漿中吸收最快，其次為肌肉。同為肌注給藥方式，大黃魚血藥達(dá)峰時(shí)間小于大菱鲆(0.5 h)[5]、異育銀鯽(0.75 h)[15]、烏鱧(2 h)[11]，大于擬穴青蟹(0.017 h)[19]、中華絨螯蟹(0.083 h)[22]、羅氏沼蝦(0.083 h)[18]。這說明在肌注給藥方式下，大黃魚恩諾沙星吸收速率大于大菱鲆、異育銀鯽和烏鱧，小于擬穴青蟹、中華絨螯蟹和羅氏沼蝦。

分布半衰期T1/2α、表觀曲線下面積AUC和表觀分布容積V1/F是反映藥物在體內(nèi)分布的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)條件下，大黃魚血漿、肌肉、肝臟和性腺T1/2α分別為1.085、 12.579、 7.155、 18.642 h，V1/F分別為1.782、 0.712、 1.882、 2.115 L/kg。AUC較大，說明恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)分布廣泛，可以起到很好的殺菌作用。在肌注給藥方式下，大黃魚血漿T1/2α與大菱鲆(0.987 h)[5]相近，小于異育銀鯽(4.925 h)[15]，大于中華絨螯蟹(0.580 h)[22]和羅氏沼蝦(0.581 h)[18]。

消除半衰期T1/2β和清除率CL/F是反映藥物在體內(nèi)消除快慢的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)條件下，大黃魚血漿、肌肉、肝臟和性腺T1/2β分別為30.484、 51.971、 47.823、 69.315 h，CL/F分別為0.210、 0.033、 0.080、 0.072 L/(h·kg)，這說明恩諾沙星在血漿中消除的最快。在肌注給藥方式下，大黃魚血漿T1/2β小于大菱鲆(68.003 h)[5]、擬穴青蟹(57.02 h)[19]、中華絨螯蟹(83.833 h)[22]、羅氏沼蝦(69.315 h)[18]，大于異育銀鯽(9.292 h)[15]。大黃魚血漿CL/F與雜交鱘[0.228 8 L/(h·kg)][12]較為接近，大于歐洲鰻鱺[0.074 L/(h·kg)][9]和牙鲆[0.083 L/(h·kg)][24]。這說明大黃魚消除速率與雜交鱘接近，大于大菱鲆、牙鲆、歐洲鰻鱺、擬穴青蟹、中華絨螯蟹和羅氏沼蝦，小于異育銀鯽。

由上可見，在肌注給藥方式下，恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)總體吸收、分布和消除較快。

喹諾酮類藥物對(duì)常見細(xì)菌的治療效果通常與藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)參數(shù)有關(guān)。一般認(rèn)為，當(dāng)血漿中藥物的峰濃度(Cmax)與最低抑菌濃度(MIC)的比值達(dá)到10以上時(shí)，即可起到良好的治療效果，并且當(dāng)Cmax/ MIC=10時(shí)，效果最佳[25-26]。馬寅等[27]測得恩諾沙星對(duì)溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、最小弧菌(V.mimicus)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)等4種常見的水產(chǎn)治病弧菌的MIC為0.1～0.8 mg/L，由此得到本實(shí)驗(yàn)CmaxMIC為51.9 ～ 415。可見，在本實(shí)驗(yàn)條件下，肌注恩諾沙星對(duì)大黃魚常見的細(xì)菌性疾病可以起到較好的治療效果。

為了保持一定的穩(wěn)態(tài)血藥濃度，徐叔云等[28]提出了穩(wěn)態(tài)血藥濃度Css的計(jì)算公式，見式(2)。

式(2)

式(2)中，Css為期望達(dá)到的穩(wěn)態(tài)血藥濃度；F為生物利用度；X0為每次給藥劑量；Vd為表觀分布容積；K10為藥物在中央室的消除速率；τ為給藥時(shí)間間隔。由表4可知，Vd=1.782 L/kg，K10=0.118 1/h。MIC按平均值0.45 mg/L計(jì)，Css按10倍MIC計(jì)，Css= 4.5 mg/L，F(xiàn)按80%計(jì)。結(jié)合消除半衰期T1/2β為30.484 h，建議一天給藥一次，τ=24 h。根據(jù)上述公式，得到X0=28.4 mg/kg。因此，對(duì)大黃魚可采取如下給藥方案：按魚體重每次肌注恩諾沙星28.4 mg/kg，一天一次，連續(xù)給藥2次。

3.2 恩諾沙星代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在大黃魚體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征

環(huán)丙沙星為禁用藥物，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中禁止使用，但本實(shí)驗(yàn)中在大黃魚體內(nèi)檢出的環(huán)丙沙星并不是由直接肌注給藥產(chǎn)生的，而是恩諾沙星在代謝過程中產(chǎn)生的。此外，中國農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告中的恩諾沙星殘留限量為恩諾沙星和其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的總殘留量。因此，研究恩諾沙星代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在大黃魚體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)同樣具有重要意義。恩諾沙星有多種代謝途徑，最主要的是脫去乙基代謝成為環(huán)丙沙星，但其代謝程度存在種屬差異。王洪艷等[24]研究恩諾沙星在牙鲆體內(nèi)的代謝規(guī)律發(fā)現(xiàn)，環(huán)丙沙星在血液、肝臟和腎臟中均可檢出，但在肌肉中未檢出。Koc等[29]對(duì)褐鱒(Salmotrutta)進(jìn)行靜脈注射和口灌恩諾沙星實(shí)驗(yàn)，血漿中均未檢測到環(huán)丙沙星。在本研究中，環(huán)丙沙星在大黃魚血漿、肌肉、肝臟和性腺中均可檢出，但環(huán)丙沙星占恩諾沙星和環(huán)丙沙星總量的比值很低，絕大部分都在15%以下，其中血漿中的環(huán)丙沙星占比絕大部分都在5%以下。這說明恩諾沙星進(jìn)入大黃魚體內(nèi)后，絕大部分以原藥形式存在，僅有少部分脫去乙基代謝為環(huán)丙沙星。

應(yīng)用DAS 2.0 軟件對(duì)大黃魚體內(nèi)的環(huán)丙沙星濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行房室模型分析，發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星在大黃魚體內(nèi)的代謝過程不符合一室和二室模型。環(huán)丙沙星在血漿中的最大質(zhì)量濃度為0.693 mg/L，在肝臟、肌肉和性腺中的最大含量分別為3.96、 0.579、 1.11 mg/kg。環(huán)丙沙星在肝臟、血漿、肌肉和性腺中的含量達(dá)到最大值的時(shí)間依次為1、 1、 24、 24 h。由此可以看出，肝臟中環(huán)丙沙星的最大含量明顯高于血漿、肌肉和性腺的最大含量，并且達(dá)到最大含量的時(shí)間明顯早于肌肉和性腺，這說明恩諾沙星是在肝臟中脫去乙基代謝成環(huán)丙沙星，然后通過血液循環(huán)輸送到大黃魚其他組織。在給藥后的前5天，環(huán)丙沙星在各組織中的含量首先上升，達(dá)到最大濃度后，其含量整體呈下降趨勢，但其間也會(huì)出現(xiàn)濃度上升和保持平穩(wěn)的現(xiàn)象，這可能是由于恩諾沙星在不斷代謝為環(huán)丙沙星的同時(shí)，環(huán)丙沙星自身也在不斷的進(jìn)行代謝造成的。

3.3 恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在大黃魚體內(nèi)的殘留消除規(guī)律

大黃魚體內(nèi)的恩諾沙星含量在給藥后的前48小時(shí)下降明顯，這說明在給藥后的前48小時(shí)恩諾沙星消除較快，之后保持穩(wěn)定下降，但消除速率明顯變慢。恩諾沙星在血漿、肌肉、肝臟和性腺中的消除半衰期分別為30.484、 51.971、 47.823、 69.315 h，由此可見，恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)整體消除較快，但在不同組織中存在一定的差異，消除速率由大到小依次是血漿、肝臟、肌肉和性腺。

恩諾沙星進(jìn)入大黃魚體內(nèi)后，僅有少部分代謝成環(huán)丙沙星。在給藥后的前96 小時(shí)，環(huán)丙沙星濃度下降速度較快，之后消除速率變慢。由環(huán)丙沙星消除曲線方程得到環(huán)丙沙星在血漿、肌肉、肝臟和性腺中的消除半衰期分別為28.88、 57.75、 43.31、 40.76 h。由此可知，環(huán)丙沙星在大黃魚體內(nèi)整體消除較快，但在不同組織中存在一定的差異，其中在血漿中消除的最快，在肌肉中消除的最慢。

3.4 休藥期的確定

休藥期是根據(jù)食用組織中藥物的允許殘留量和藥物的消除速率來確定的。中國農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告規(guī)定恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星總殘留量在水產(chǎn)動(dòng)物肌肉中不得超過100 μg/kg。藥物消除速率在實(shí)際養(yǎng)殖中則受多種因素的影響，主要包括水產(chǎn)動(dòng)物的種屬、規(guī)格、養(yǎng)殖水溫、給藥劑量、給藥方式、水質(zhì)狀況、光照條件等[30]。本實(shí)驗(yàn)于2016年12月至2017年2月進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)大黃魚規(guī)格為200～300 g，對(duì)大黃魚進(jìn)行恩諾沙星肌注給藥，給藥水平為50 mg/kg，給藥后進(jìn)行正常飼養(yǎng)，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，養(yǎng)殖池水溫從23 ℃逐漸下降至17 ℃，在此實(shí)驗(yàn)條件下，以肌肉作為靶組織，根據(jù)休藥期公式，計(jì)算得到恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)的休藥期為18.7 d。因此，在本實(shí)驗(yàn)條件下，建議休藥期不低于19 d。與本實(shí)驗(yàn)采取肌注給藥方式研究恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)不同，大多數(shù)研究者采取的是口灌和投喂給藥方式。李娜等[6]在11～12 ℃水溫條件下，以30 mg/kg的劑量對(duì)大菱鲆連續(xù)口服恩諾沙星7 d，每天2次，在停藥后的第94天，恩諾沙星殘留量仍超過限量標(biāo)準(zhǔn)。常志強(qiáng)等[7]在20 ℃水溫條件下，以30 mg/kg劑量的恩諾沙星對(duì)大菱鲆、牙鲆和半滑舌鰨連續(xù)進(jìn)行灌胃3 d，得到大菱鲆、牙鲆和半滑舌鰨的休藥期分別為44、 33、 47 d。郭嬌嬌等[12]以10 mg/kg的劑量對(duì)雜交鱘單次口灌給藥，得到恩諾沙星在雜交鱘中的休藥期至少為20 d。李佳蔚等[13]在18 ℃水溫條件下，以20 mg/kg的劑量對(duì)黑裙單次灌服給藥，得到黑裙的休藥期至少為35 d。徐維海等[14]以50 mg/kg的劑量對(duì)吉富羅非魚和中國對(duì)蝦連續(xù)投喂7 d，得到吉富羅非魚的休藥期為22 d，中國對(duì)蝦的休藥期為12 d。余開等[20]以10 mg/kg的劑量對(duì)三疣梭子蟹口灌給藥，得到三疣梭子蟹的休藥期為14 d。由此可見，在不同的實(shí)驗(yàn)條件下，得到的恩諾沙星休藥期數(shù)據(jù)均存在一定的差異。這說明休藥期與水產(chǎn)動(dòng)物的種屬、給藥方式、給藥劑量以及養(yǎng)殖水溫等密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采取肌注給藥方式進(jìn)行研究，可以精確控制每一個(gè)實(shí)驗(yàn)個(gè)體的藥物注射劑量，因此能更準(zhǔn)確地考察藥物的代謝情況?？诠嘟o藥操作難度較大，在實(shí)際生產(chǎn)中無法廣泛采用；投喂給藥與實(shí)際生產(chǎn)較為接近，但存在部分藥物易擴(kuò)散到水體中，并且由于個(gè)體進(jìn)食量的差異，無法準(zhǔn)確獲得單個(gè)個(gè)體的實(shí)際給藥量。梁俊平等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在肌注給藥條件下，恩諾沙星的吸收和消除均快于口服給藥，并且比口服給藥吸收完全。因此，盡管本研究與實(shí)際生產(chǎn)存在一定差異，但仍可以為在大黃魚實(shí)際生產(chǎn)過程中科學(xué)使用恩諾沙星提供參考。

4 結(jié)論

在(20±3)℃水溫條件下，以50 mg/kg恩諾沙星肌注大黃魚后，恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)吸收、分布迅速，消除較快。以肌肉作為靶組織，根據(jù)休藥期公式，計(jì)算得到恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)的休藥期為18.7 d。因此，在本實(shí)驗(yàn)條件下，建議休藥期不低于19 d。該研究結(jié)果可為大黃魚在實(shí)際養(yǎng)殖過程中科學(xué)使用恩諾沙星提供參考。

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