劉麗麗，呂鵬，閆艷春

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院， 北京 100081； 2.北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，水族技術(shù)研究室， 北京 100068)

近年來，全球各地自然環(huán)境中頻繁檢測到抗生素的痕跡，這些抗生素大多數(shù)為人用非處方藥、獸用抗生素和飼料添加劑，消費(fèi)使用量大，排放時(shí)間持久，在環(huán)境中廣泛存在，其對于非靶標(biāo)生物特別是水生生物的毒性作用逐漸受到重視。以中國為例，2013年全國36種常用抗生素總消耗量約為92 700 t，其中54 000 t抗生素經(jīng)由人類和動(dòng)物排泄到體外，經(jīng)過各種污水處理系統(tǒng)，最終53 800 t抗生素進(jìn)入自然環(huán)境中[1]。在各種抗生素污染物中，磺胺類是在水體環(huán)境中檢出頻率和檢測濃度較高的抗生素污染物之一，典型的磺胺類污染物磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine，SMZ)在德國地下水中的質(zhì)量濃度最高為0.16 μg/L[2]，在美國主要河流中的平均質(zhì)量濃度為2.2 μg/L[3]，湄公河三角洲地區(qū)地表水中質(zhì)量濃度高達(dá)19.2 μg/L[4]。由于磺胺類抗生素大量用于畜牧業(yè)和漁業(yè)生產(chǎn)，磺胺污染物在養(yǎng)殖場和污水排放口等環(huán)境中的檢測濃度可能更高[5]。

磺胺類污染物對水生植物和低等生物表現(xiàn)出不同程度的毒性作用。例如，質(zhì)量濃度為mg/L級的磺胺間甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine)急性暴露能夠抑制水生無脊椎動(dòng)物和藻類生長[6]；濃度為μmol/L級的磺胺胍(sulfaguanidine)、磺胺噻唑(sulfathiazole)等磺胺類抗生素長期暴露會(huì)導(dǎo)致低等水生動(dòng)物存活率顯著下降[7]。當(dāng)前研究主要集中于抗生素類污染物的環(huán)境行為及其對水生植物和低等動(dòng)物的發(fā)育毒性作用，而抗生素污染物對水生脊椎動(dòng)物，特別是魚類的發(fā)育毒性，則鮮有報(bào)道。因此，本研究以脊椎動(dòng)物模式生物斑馬魚胚胎為受試對象，參照OECD 236指導(dǎo)文件關(guān)于魚類胚胎急性毒性試驗(yàn)(fish embryo toxicity test，F(xiàn)ET)方法，研究以SMZ為代表性藥物的磺胺類污染物對其的急性毒性。通過分析SMZ對斑馬魚胚胎的暴露時(shí)間-致死率曲線和藥物濃度-致死率曲線，分析SMZ對斑馬魚胚胎死亡率、孵化率的影響和SMZ對斑馬魚胚胎發(fā)育的致畸效應(yīng)，從而確定SMZ的毒性參數(shù)和毒性效應(yīng)，評價(jià)SMZ對魚類的急性毒性作用，為抗生素污染物對魚類安全的影響提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

磺胺二甲嘧啶鈉(sulfamethazine sodium, Cas 1981-58-4，Lot 4QCTD-00)購買自東京化成工業(yè)株式會(huì)社，純度>97.0%。甲醇、NaCl、NaHCO3等常規(guī)有機(jī)化學(xué)試劑和無機(jī)化學(xué)試劑購買自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，其中甲醇、磷酸二氫鉀等用于高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)分析的試劑純度為色譜純。

儀器主要包括：斑馬魚獨(dú)立養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛生科技發(fā)展有限公司)、高效液相色譜(Agilent 1200)、恒溫光照培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)、體視顯微鏡(Leica EZ4 HD)、倒置顯微鏡(Olympus IX2)、超純水儀(Millipore)、電子天平(Mettler Toledo)、濾膜(津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型AB品系斑馬魚購于國家斑馬魚資源中心(武漢)，在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵守動(dòng)物倫理學(xué)操作規(guī)范。毒理實(shí)驗(yàn)以96 hpf(hours post fertilization)內(nèi)的斑馬魚胚胎為受試動(dòng)物，是因?yàn)榘唏R魚胚胎(<120 hpf)不具有感知疼痛的能力，胚胎實(shí)驗(yàn)不受到動(dòng)物福利相關(guān)法規(guī)的限制[8]。斑馬魚養(yǎng)殖條件為：獨(dú)立養(yǎng)殖系統(tǒng)飼養(yǎng)繁殖斑馬魚，自動(dòng)照明系統(tǒng)保持光照/黑暗(14 h/10 h)循環(huán)，冷熱兩用空調(diào)保持室溫(28±0.5)℃，排風(fēng)扇定時(shí)排除室內(nèi)水氣，避免濕度過大；水循環(huán)系統(tǒng)使用處理后的自來水，即經(jīng)過除雜、除氯、凈化和紫外消毒，添加NaCl和NaHCO3，保持電導(dǎo)率為500～550 μs/cm，pH 為7.0～7.5；廢物處理系統(tǒng)自動(dòng)過濾魚的糞便和剩余魚食，廢水排出后自動(dòng)補(bǔ)充新鮮養(yǎng)魚水。每日喂食新鮮豐年蝦2次。

1.2.2 溶液配制與HPLC檢測

將100 mg磺胺二甲嘧啶鈉粉末溶解于100 mL E3 buffer緩沖液(5 mmol/L NaCl，0.17 mmol/L KCl，0.33 mmol/L CaCl2，0.33 mmol/L MgSO4)，配制成1 g/L儲(chǔ)液，避光保存于4 ℃。使用時(shí)稀釋至工作濃度(0.001、 0.01、 0.1、 1、 10、 100、 300、 500、 700和1 000 mg/L)，通過HPLC檢測并確認(rèn)其濃度。HPLC檢測方法參見文獻(xiàn)[9]，具體為：以甲醇-磷酸二氫鉀溶液(35∶65，V/V)為流動(dòng)相，檢測波長210 nm，Promosil C18柱(250mm×4.6mm，5μm，100 ?)為分離色譜柱。其中，磷酸二氫鉀溶液配制方法為取KH2PO413.6 g，加適量去離子水溶解，用2% KOH溶液調(diào)pH至5.3，繼續(xù)加去離子水定容至1 000 mL。設(shè)置流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為2 μL。樣品上機(jī)前先進(jìn)行25 000 g離心5 min，并用0.22 μm濾膜過濾。

1.2.3 胚胎急性毒性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)開始前一天下午，挑選健康、發(fā)育一致的成年斑馬魚(10月齡)，按照雌雄比例1∶1轉(zhuǎn)移到配魚盒內(nèi)，用隔板隔開，配魚盒環(huán)境條件與斑馬魚養(yǎng)殖條件一致。次日光照開始后，抽隔板，斑馬魚開始追尾交配，30 min后收集受精卵。受精卵用E3 buffer輕輕清洗兩次，在顯微鏡下挑選成功受精、發(fā)育階段一致的受精卵，用于毒性暴露實(shí)驗(yàn)。胚胎毒性實(shí)驗(yàn)在OECD 236指導(dǎo)文件[10]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置1個(gè)對照組(E3 buffer組)和10個(gè)處理組，處理組分別為0.001、 0.01、 0.1、 1、 10、 100、 300、 500、 700和1 000 mg/L SMZ溶液。每組60個(gè)胚胎(n=60)，所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。胚胎在3 hpf前轉(zhuǎn)移到6孔板內(nèi)，每孔10個(gè)胚胎、15 mL處理液。6孔板在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，14 h/10 h光照黑暗循環(huán)，每隔24 h更換2/3體積的處理液，胚胎發(fā)育至96 hpf時(shí)停止暴露處理。SMZ溶液使用時(shí)用E3 buffer稀釋到工作濃度，并預(yù)溫至28 ℃，暴露實(shí)驗(yàn)前后都進(jìn)行HPLC檢測，確保試劑實(shí)際濃度在理論濃度±20%范圍內(nèi)[11]。

1.2.4 顯微鏡觀察與死亡、孵化胚胎數(shù)量統(tǒng)計(jì)

暴露過程中，體視顯微鏡統(tǒng)計(jì)12、 24、 48、 72、 96 hpf死亡胚胎數(shù)和48、 72、 96 hpf孵化胚胎數(shù)，Origin Pro 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；倒置顯微觀察并記錄胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)的畸形現(xiàn)象。以胚胎心臟停止跳動(dòng)為毒理學(xué)死亡終點(diǎn)。死亡率(%)=死亡胚胎數(shù)/60×100，孵化率(%)=孵化胚胎數(shù)/60×100。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

Origin Pro 8.0進(jìn)行初步數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和繪圖，Levene test檢驗(yàn)方差齊性，單因素方差分析(one-way ANOVA)確定數(shù)據(jù)顯著性。所有數(shù)值均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(n=3)表示，P<0.05表示為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 SMZ暴露濃度對斑馬魚胚胎死亡率的影響

統(tǒng)計(jì)梯度濃度SMZ溶液和對照組(E3 buffer)暴露條件下，斑馬魚胚胎在12、 24、 48、 72和96 hpf的死亡率，使用Origin Pro 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，獲得梯度濃度SMZ暴露對不同發(fā)育階段斑馬魚胚胎死亡率(圖1)，發(fā)現(xiàn)低濃度SMZ(0.001～1 mg/L)暴露對斑馬魚胚胎的死亡率沒有顯著影響，中等濃度SMZ(10～300 mg/L)暴露導(dǎo)致斑馬魚胚胎死亡率顯著降低(P<0.05)，而高濃度SMZ(500～1 000 mg/L)導(dǎo)致斑馬魚胚胎死亡率顯著上升(P<0.05)。

研究表明，在一定濃度范圍內(nèi)，SMZ降低了斑馬魚胚胎的死亡率，當(dāng)濃度高于500 mg/L時(shí)，SMZ誘導(dǎo)斑馬魚胚胎死亡率上升，對斑馬魚生長發(fā)育表現(xiàn)出毒性作用。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度SMZ對斑馬魚胚胎生長表現(xiàn)出完全相反的作用，謝美萍等[12]對斑馬魚成魚肝臟谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)活性的研究得到相似的結(jié)論：低濃度磺胺類抗生素能夠誘導(dǎo)斑馬魚肝臟GST的表達(dá)，而高濃度磺胺則抑制肝臟GST水平。因此我們推測，SMZ對斑馬魚表現(xiàn)為毒物興奮效應(yīng)(hormesis)，即在低濃度時(shí)表現(xiàn)為刺激效應(yīng)，高濃度時(shí)表現(xiàn)為抑制效應(yīng)[13]。當(dāng)濃度≥10 mg/L時(shí)，SMZ處理組96 hpf累計(jì)死亡率與對照組有顯著差異(P<0.05)。因此，以死亡率為指標(biāo)，SMZ對96 hpf斑馬魚胚胎的效應(yīng)濃度大約為10 mg/L，低于此濃度時(shí)，處理組與對照組胚胎死亡率無顯著變化(圖1)。

研究發(fā)現(xiàn)，SMZ對斑馬魚胚胎的致死毒性比較小，當(dāng)SMZ濃度達(dá)到1 000 mg/L時(shí)，其96 h致死率僅為28%左右，實(shí)驗(yàn)未檢測到SMZ對斑馬魚胚胎的96 h半數(shù)致死濃度?？紤]到環(huán)境中SMZ實(shí)際濃度范圍，我們認(rèn)為在實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)升高SMZ濃度沒有實(shí)際意義，因此不進(jìn)行更高濃度組實(shí)驗(yàn)。

2.2 SMZ暴露時(shí)間對斑馬魚胚胎死亡率的影響

隨著SMZ暴露時(shí)間延長，斑馬魚胚胎死亡率逐漸上升。當(dāng)暴露至12 hpf時(shí)，胚胎死亡率開始表現(xiàn)出劑量差異：10～300 mg/L SMZ處理組死亡率低于對照組，而700～1 000 mg/L SMZ處理組死亡率高于對照組。當(dāng)暴露時(shí)間延長至24 hpf時(shí)，10～300 mg/L SMZ處理組累計(jì)死亡率仍低于對照組，而1 000 mg/L SMZ處理組累計(jì)死亡率高于對照組。隨著暴露時(shí)間進(jìn)一步延長，10～300 mg/L SMZ處理組累計(jì)死亡率趨于穩(wěn)定，700～1 000 mg/L SMZ處理組累計(jì)死亡率隨著暴露時(shí)間延長繼續(xù)上升，表現(xiàn)出時(shí)間依賴性(圖2)。

圖1 梯度濃度SMZ對斑馬魚胚胎的致死率的影響*表示與對照組相比，有顯著差異，P<0.05。下同。Fig.1 Effects of gradient SMZ on mortality rates of zebrafish embryos(n=3)* represents significant difference compared to control group,P<0.05.The same below.

圖2 SMZ誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎死亡率隨時(shí)間的變化趨勢Fig.2 Time-dependent mortality rates of zebrafish embryos exposed to SMZ

2.3 SMZ暴露濃度對斑馬魚胚胎孵化率的影響

孵化是斑馬魚胚胎發(fā)育的重要階段，只有完成胚胎孵化，幼魚才能開口進(jìn)食和自由游動(dòng)。如果胚胎不能打破絨毛膜的屏障，順利完成孵化，最終會(huì)死亡。孵化是生理、生化和滲透機(jī)制共同作用的結(jié)果[14]，斑馬魚胚胎孵化通常開始于48 hpf，到72 hpf時(shí)胚胎全部孵化完成[8]。

本研究統(tǒng)計(jì)了梯度濃度SMZ對斑馬魚胚胎孵化率的影響，發(fā)現(xiàn)隨著SMZ暴露濃度的增加，48hpf胚胎孵化率表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(圖3)，具體表現(xiàn)為：當(dāng)SMZ濃度低于0.1 mg/L時(shí)，胚胎孵化率與對照組相比沒有顯著變化；當(dāng)濃度為1～700 mg/L時(shí)，胚胎48 hpf孵化率顯著高于對照組(P<0.05)，并且當(dāng)SMZ暴露濃度為100 mg/L時(shí)，48 hpf孵化率最高；當(dāng)SMZ濃度進(jìn)一步升高，達(dá)到1 000 mg/L時(shí)，48 hpf孵化率顯著低于對照組(P<0.05)。研究表明，當(dāng)以胚胎48 hpf孵化率為毒性參數(shù)時(shí)，SMZ的效應(yīng)濃度為1 mg/L；當(dāng)SMZ濃度為1～700 mg/L時(shí)，能夠促進(jìn)斑馬魚胚胎孵化，而當(dāng)SMZ濃度進(jìn)一步升高時(shí)，對斑馬魚胚胎孵化具有抑制作用。

圖3 梯度濃度SMZ暴露條件下斑馬魚胚胎孵化率Fig.3 Hatching rates (%) of zebrafish embryos exposed to gradient SMZ

孵化既是斑馬魚胚胎發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)期，也是評估化學(xué)物質(zhì)對魚類作用的一個(gè)主要毒理學(xué)終點(diǎn)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，不同的化學(xué)物質(zhì)對斑馬魚胚胎孵化過程的作用各不相同，2,4-二羥基二苯醚(HODE-15)、4,4′-二氟二苯醚[15](FDE-15)和散沫花染料(henna)[16]等物質(zhì)會(huì)顯著降低斑馬魚胚胎孵化率；而聯(lián)苯菊酯、苯并(a)芘和乙酸三苯錫能夠促進(jìn)斑馬魚胚胎孵化過程[17]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，胚胎孵化一方面是由于孵化酶(hatching enzyme)消化絨毛膜，另一方面是由于胚胎物理性運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的機(jī)械力會(huì)撕破絨毛膜，滲透機(jī)制可能也參與了這一過程[18]。

因此我們推測，本研究中SMZ促進(jìn)和抑制胚胎孵化的現(xiàn)象是多種生理生化機(jī)制共同作用的結(jié)果。低濃度SMZ促進(jìn)孵化而高濃度SMZ抑制孵化的現(xiàn)象說明SMZ對斑馬魚可能具有毒物興奮效應(yīng)。

2.4 SMZ暴露對斑馬魚胚胎發(fā)育的致畸效應(yīng)

本研究發(fā)現(xiàn)，SMZ暴露導(dǎo)致斑馬魚胚胎發(fā)育畸形，包括斑馬魚胚胎脊柱彎曲(圖4B)、心包囊腫(圖4B)、色素生成增加(圖4B)、尾部缺失(圖4C)、軀干發(fā)育不全(圖4D)等。本研究中，當(dāng)SMZ濃度為10～1 000 mg/L時(shí)，48 hpf和72 hpf都觀察到明顯的畸形胚胎，說明SMZ對斑馬魚胚胎的致畸效應(yīng)開始于48 hpf以前，而在以往文獻(xiàn)報(bào)道中，通常在72 hpf及以后觀察到化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的致畸現(xiàn)象[19]?？梢酝茰y，SMZ對斑馬魚胚胎早期發(fā)育(48 hpf以前)具有嚴(yán)重的致畸性。48 hpf是胚胎開始孵化的時(shí)期，在此階段之前胚胎被絨毛膜包被，受到絨毛膜的保護(hù)，本研究表明，絨毛膜屏障不能保護(hù)胚胎免受來自SMZ的毒性作用。

圖4 SMZ誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎發(fā)育畸形(放大倍數(shù)：2.5×16)(A)72 hpf對照組；(B)72 hpf，0.001 mg·L-1 SMZ處理組；(C)48 phf，1mg·L-1 SMZ處理組；(D)48 hpf，10 mg·L-1SMZ處理組。Fig.4 Teratogenesis images of zebrafish embryos exposed to SMZ(Magnification: 2.5×16)(A) 72 hpf(control);(B) 72 hpf treated with 0.001 mg·L-1 SMZ(C) 48 hpf treated with 1 mg·L-1 SMZ;(D)48 hpf treated with 10 mg·L-1 SMZ.

胚胎畸形如心包囊腫和尾部彎曲是常見的毒理學(xué)終點(diǎn)[20]，通常與毒性物質(zhì)的分子靶標(biāo)相關(guān)，因此具有高度敏感性。胚胎畸形現(xiàn)象通常作為藥物非致死效應(yīng)的主要指標(biāo)之一，在毒性評價(jià)中具有重要的意義，有利于分析藥物對機(jī)體造成的神經(jīng)肌肉、生理、表觀或行為損傷，確定藥物對胚胎發(fā)育的影響。

本研究還發(fā)現(xiàn)，0.001 mg/L暴露72 h會(huì)導(dǎo)致斑馬魚胚胎嚴(yán)重畸形現(xiàn)象，說明當(dāng)以致畸效應(yīng)作為毒性參數(shù)時(shí)，SMZ對72 hpf斑馬魚胚胎的效應(yīng)濃度為0.001 mg/L，遠(yuǎn)低于以死亡率為毒性參數(shù)時(shí)的效應(yīng)濃度，而接近SMZ在水體環(huán)境中的實(shí)際檢測濃度?？梢?，與致死效應(yīng)相比，SMZ對斑馬魚胚胎的致畸效應(yīng)更顯著。下一步，我們將明確SMZ對斑馬魚胚胎致畸的劑量效應(yīng)，探索SMZ致畸的分子機(jī)制，深入分析SMZ對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性作用，從而預(yù)測低濃度SMZ對魚類胚胎發(fā)育的致畸效應(yīng)，為相關(guān)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供數(shù)據(jù)支持。

3 結(jié)論

以死亡率為毒性參數(shù)，SMZ對96 hpf斑馬魚胚胎的效應(yīng)濃度為10 mg/L；10～300 mg/L SMZ有利于提高斑馬魚胚胎存活率；當(dāng)濃度高于500 mg/L時(shí)，SMZ誘導(dǎo)斑馬魚胚胎死亡，對斑馬魚生長發(fā)育表現(xiàn)出毒性作用。500 mg/L SMZ對斑馬魚胚胎的致死效應(yīng)主要發(fā)生于48 hpf內(nèi)；當(dāng)濃度≥700 mg/L時(shí)，SMZ對斑馬魚胚胎的致死效應(yīng)具有時(shí)間依賴性。

當(dāng)以孵化率為毒性參數(shù)時(shí)，SMZ對48 hpf斑馬魚胚胎的效應(yīng)濃度為1 mg/L；1～700 mg/L SMZ促進(jìn)48 hpf斑馬魚胚胎孵化；而1 000 mg/L SMZ對斑馬魚胚胎孵化具有抑制作用。

當(dāng)以致畸效應(yīng)為毒性參數(shù)時(shí)，SMZ對斑馬魚胚胎的效應(yīng)濃度為0.001 mg/L；SMZ對斑馬魚胚胎具有致畸效應(yīng)，誘導(dǎo)胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)脊柱彎曲、心包囊腫、色素生成增加、尾部缺失、軀干發(fā)育不全等畸形現(xiàn)象。

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