陳俊林+黃飛+徐費凡

[摘要] 目的 探討Xpert MTB/RIF與BACTEC MGIT960在檢測結(jié)核分枝桿菌（MTB）及利福平（RFP）耐藥性出現(xiàn)差異的原因。方法 選擇2014年6月～2017年6月在南通市第六醫(yī)人民院就診的188例復(fù)治肺結(jié)核患者的涂陽痰標(biāo)本作為研究對象，分別采用Xpert MTB/RIF及BACTEC MGIT960檢測MTB及RFP耐藥性并結(jié)合患者用藥史對結(jié)果進行分析。結(jié)果 兩種方法檢測出一致性結(jié)果146例，差異性結(jié)果38例。使用過含利福霉素類藥物且用藥時間>3個月病例組，Xpert MTB/RIF檢測出的RFP耐藥性病例數(shù)高于BACTEC MGIT960，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2 = 6.31，P < 0.05），其余各組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)論 Xpert MTB/RIF與BACTEC MGIT960檢測涂陽痰標(biāo)本MTB及RFP耐藥性會出現(xiàn)部分差異性結(jié)果，可能與患者的用藥史有關(guān)，臨床醫(yī)師應(yīng)重視兩種檢查方法的差異性并準(zhǔn)確制訂抗結(jié)核治療方案。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)核分枝桿菌；利福平；藥敏試驗；XpertMTB/RIF；BACTEC MGIT960

[中圖分類號] R563.1 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）01（a）-0049-04

[Abstract] Objective To explore the differences between Xpert MTB/RIF and BACTEC MGIT960 in detecting Mycobacterium tuberculosis （MTB） and Rifampin （RFP） resistance. Methods From June 2014 to June 2017， sputum specimens from 188 retreated smear positive pulmonary tuberculosis patients in the Sixth People's Hospital of Nantong were selected as research objects. Xpert MTB/RIF and BACTEC MGIT960 were used to detect MTB in the sputum specimens of the patients and the RFP resistance was analyzed combined with the medical history. Results Then were 146 cases of consistency results between Xpert MTB/RIF and BACTEC MGIT960 in detecting MTB， while 38 cases of heterogeneity. The number of cases in Xpert MTB/RIF group was higher than that of BACTEC MGIT960 group in the use of the drug with rifamycin and the duration above 3 months， with statistically significant difference （χ2=6.31，P < 0.05）. There were no statistically significant differences between Xpert MTB/RIF and BACTEC MGIT960 in the comparison of other medical history groups （P > 0.05）. Conlusion The results of Xpert MTB/RIF and BACTEC MGIT960 in detecting MTB and RFP resistance from sputum specimens of smear positive are differential. It may be associated with medical history of the patients. Clinical physicians should pay attention to the differences of the two detection methods and formulate anti-tuberculosis treatment plan accurately.

[Key words] Mycobacterium tuberculosis； Rifampicin； Drug sensitive test； XpertMTB/RIF； BACTEC MGIT960

耐利福平（RFP）結(jié)核?。∕TB）的診治仍然是國內(nèi)外關(guān)注的重點[1-2]，本地區(qū)疾控機構(gòu)流行病學(xué)調(diào)查顯示，耐RFP結(jié)核病近幾年呈明顯上升趨勢[3]。如果能在就診的肺結(jié)核患者中快速、準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)耐RFP的MTB并及時更改抗結(jié)核治療方案，就可以避免低濃度耐藥MTB演變?yōu)楦邼舛饶退嶮TB并獲得穩(wěn)定遺傳和繁殖。傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)及比例法藥敏技術(shù)雖然是結(jié)核菌耐藥檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但檢測需耗時1～2個月，不能滿足臨床需要。BACTEC MGIT960檢測MTB及藥物敏感性和傳統(tǒng)的羅培藥敏高度一致，耗時僅需要半月左右，可替代傳統(tǒng)培養(yǎng)及藥敏檢測[4-5]。目前流行的XpertMTB/RIF技術(shù)檢測標(biāo)本中MTB及RFP耐藥僅需要幾小時就能報告結(jié)果，已在臨床應(yīng)用中得到高度評價[6-7]。但實際應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)XpertMTB/RIF技術(shù)和BACTEC MGIT960在MTB及RFP耐藥性檢測方面存在一定差異，可能會對制訂抗結(jié)核方案帶來困惑?；谝陨显?，筆者對近3年采用這兩種檢測方法所得到結(jié)果進行了比較。現(xiàn)報道如下：endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 菌株來源 MTB標(biāo)準(zhǔn)株（H37Rv ATCC27294）購自國家菌種保藏中心，188例涂陽痰標(biāo)本來自2014年6月～2017年6月在南通市第六人民醫(yī)院就診的復(fù)治肺結(jié)核患者。其中男115例，女73例，年齡27～82歲，平均（50.7±2.0）歲。對每例復(fù)治涂陽肺結(jié)核患者均詳細記錄用藥史、癥狀及胸部CT檢查情況。

1.1.2 主要試劑和儀器 RFP購自美國Fluka公司；Bactec MGIT檢測儀、Bactec MGIT試劑、61010A-1型比濁儀購自美國BD（Becton Dickinson）公司；GNP-92700隔水式培養(yǎng)箱購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司；GeneXpert儀器及Xpert MTB/RIF檢測試劑盒購自美國Cepheid公司。

1.2 方法

1.2.1 抗酸染色涂片檢測 按照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[8]中的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序進行操作。報告方式：100倍物鏡按1+～4+進行分級。

1.2.2 標(biāo)本處理 取干酪樣或膿樣晨痰1 mL于試管內(nèi)，加入4 mL 4%NaOH并進行振蕩使痰液充分消化，移入37℃水浴箱，15 min后用1 mmol/L的磷酸鹽緩沖液中和，3000 r/min 離心30 min后移入37℃水浴電熱恒箱內(nèi)。

1.2.3 BACTEC MGIT960 按照BACTEC MGIT960操作說明，吸取0.5 mL標(biāo)本處理液加入到MGIT液體培養(yǎng)管中進行MTB培養(yǎng)，取陽性第3天～第5天培養(yǎng)管，無菌吸取1 mL陽性肉湯至4 mL無菌生理鹽水中作為稀釋菌液，再以此稀釋菌液1∶100稀釋作為對照菌液，分別以無菌方法加入500 μL對照菌液和稀釋菌液于BACTEC MGIT960對照管及加有RFP的藥物培養(yǎng)管中顛倒混勻（培養(yǎng)基的藥物濃度為1.0 mg/mL）。放入BACTEC MGIT960培養(yǎng)箱中，15 d之內(nèi)儀器自動報告敏感與耐藥結(jié)果。質(zhì)量控制：每次藥敏試驗均采用H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株作為陽性參照，進行分枝桿菌液體培養(yǎng)及RFP藥敏試驗（其中RFP培養(yǎng)基的藥物濃度為1.0 mg/mL），儀器在15 d之內(nèi)自動報告敏感與耐藥結(jié)果。

1.2.4 XpertMTB/RIF核酸擴增檢測 按試劑說明書將之前處理后標(biāo)本加入檢測反應(yīng)盒，上機進行檢測，系統(tǒng)自動進行核酸提取、擴增，目標(biāo)序列的檢測和結(jié)果判斷。2 h內(nèi)判斷患者是否患有結(jié)核及是否對RFP耐藥。反應(yīng)結(jié)束后，在檢測系統(tǒng)窗口下直接觀察測試結(jié)果[9]。結(jié)果報告：MTB檢出或未檢出。MTB檢出報告同步顯示RFP耐藥的結(jié)果：△CT≥3.5，RFP耐藥；△CT<3.5，RIF敏感（CT是指探針循環(huán)域值，△CT指探針早期CT值與晚期CT值之差）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，計數(shù)資料采用百分率表示，兩組間比較采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 188例涂陽痰標(biāo)本檢測結(jié)果

BACTEC MGIT960培養(yǎng)陰性20例，陽性168例；4例鑒定為非結(jié)核分枝桿菌，164例為結(jié)核分枝桿菌；藥敏結(jié)果顯示，耐RFP 46例。Xpert MTB/RIF檢測結(jié)果顯示，陽性177例；檢出耐RFP 68例。兩種方法同時檢出MTB 159例，均報告為陰性 2例，同時診斷RFP耐藥為40例。

2.2 BACTEC MGIT960與XpertMTB/RIF檢測結(jié)果的差異比較

兩種方法檢測出RFP敏感或耐藥一致性結(jié)果146例，差異性結(jié)果38例。2例標(biāo)本BACTEC MGIT960培養(yǎng)陽性而Xpert MTB/RIF檢出陰性，藥敏報告提示對RFP敏感；18例BACTEC MGIT960培養(yǎng)陰性而Xpert MTB/RIF檢出陽性標(biāo)本，16例Xpert MTB/RIF檢出RFP耐藥；6例BACTEC MGIT960檢測提示，RFP耐藥而Xpert MTB/RIF檢測提示RFP敏感；12例BACTEC MGIT960檢測顯示RFP敏感而Xpert MTB/RIF檢測提示RFP藥耐。

2.3 BACTEC MGIT960及XpertMTB/RIF檢測RFP耐藥差異性與患者用藥史的關(guān)系

剔除4例鑒定為非MTB患者及2例用藥史不詳患者，對182例患者留痰時所記錄的用藥時間、用藥種類進行分組，分別記錄各組痰標(biāo)本使用BACTEC MGIT960及XpertMTB/RIF檢測RFP耐藥結(jié)果。用藥時間>3個月（含利福霉素類）痰標(biāo)本組，Xpert MTB/RIF檢測出的RFP耐藥性病例數(shù)高于BACTEC MGIT960，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2 = 6.31，P < 0.05）。其余各組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

3 討論

XpertMTB/RIF和BACTEC MGIT960分別作為分子藥敏檢測技術(shù)代表和表型藥敏檢測技術(shù)代表，技術(shù)原理均非常明確，已推廣應(yīng)用于臨床快速檢測MTB及耐藥性中。兩者在檢測MTB臨床分離株及RFP耐藥性方面有極高的符合率[10-12]。但本研究發(fā)現(xiàn)，在直接檢測臨床痰標(biāo)本中，MTB及RFP耐藥性存在一定差異，如果不能正確判讀結(jié)果，可能因漏診或誤診而造成誤診誤治，將無法實現(xiàn)精準(zhǔn)治療而影響其身心健康。

有文獻報道，BACTEC MGIT960檢出MTB最低限量為1～10 CFU/mL，而Xpert MTB/RIF檢測MTB最低限量為100 CFU/mL[13]，提示BACTEC MGIT960對微量MTB的檢出能力具有優(yōu)越性。但BACTEC MGIT 960僅能對標(biāo)本中活菌進行檢測，對已死亡的MTB則無法檢測，對活力極弱的MTB如休眠菌則檢出能力下降，而Xpert MTB/RIF檢測的標(biāo)靶為MTB特有的DNA片段，對活菌或DNA未降解的死亡MTB均具有檢測能力。本組部分病例已經(jīng)過有效抗結(jié)核治療，雖然痰涂片仍然陽性，但MTB可能已死亡或接近死亡，會出現(xiàn)BACTEC MGIT960培養(yǎng)陰性而Xpert MTB/RIF檢出陽性，能很好地解釋本研究中Xpert MTB/RIF比BACTEC MGIT960檢出率更高的反差現(xiàn)象。另外，在復(fù)治肺結(jié)核患者中，結(jié)核分枝桿菌L型（MTB-L）存在比例非常高[14-15]，MTB-L不易被結(jié)核藥物清除，經(jīng)過治療后的痰標(biāo)本中可能同時存在死亡MTB和活的MTB-L，因培養(yǎng)條件不同可以出現(xiàn)導(dǎo)致表型藥敏技術(shù)和分子藥敏技術(shù)檢測結(jié)果不一致的現(xiàn)象，這就要求仔細分析病史及用藥史才能分析兩種方法檢測MTB出現(xiàn)不一致結(jié)果的可能原因。endprint

從檢測耐藥性能看，BACTEC MGIT960是現(xiàn)今最好的自動化MTB表型藥敏檢測系統(tǒng)，能檢出標(biāo)本中微量耐藥MTB，但對死亡的MTB、休眠MTB、MTB-L等無法進行藥敏檢測。XpertMTB/RIF所采用精密設(shè)計的分子探針能高效檢測到rpoB核心區(qū)基因突變情況，而rpoB基因具有鑒定RFP耐藥菌株的能力[16-17]。理論上XpertMTB/RIF對活的MTB、MTB-L或DNA未降解的死亡MTB均具有RFP耐藥檢測能力，基本涵蓋MTB各種可能存在狀態(tài)，因此僅有XpertMTB/RIF報告檢測到送檢標(biāo)本中存在耐藥菌而MGIT960培養(yǎng)陰性或者報告對RFP敏感，要謹慎改變治療方案。如果標(biāo)本中存在異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象[18]，rpoB基因發(fā)生突變的MTB比例過低，Xpert MTB/RIF可能無法檢測到耐RFP的MTB而BACTEC MGIT960檢測到對RFP耐藥MTB，可能要對治療方案進行調(diào)整。

本研究結(jié)果顯示，使用XpertMTB/RIF技術(shù)和BACTEC MGIT960在MTB及RFP耐藥性檢測方面存在一定差異，與復(fù)治涂陽肺結(jié)核患者是否使用了包含RFP抗結(jié)核藥物組成的方案及用藥時間有一定相關(guān)性。正是因為患者送檢痰標(biāo)本的時間節(jié)點不同，即有的患者送痰標(biāo)本時未開始接受治療，有的正在接受治療或有的已經(jīng)過長時間治療，有的治療方案中包含RFP，這時痰標(biāo)本中MTB存在狀態(tài)可能出現(xiàn)多樣性，最終導(dǎo)致了BACTEC MGIT960和XpertMTB/RIF檢測結(jié)果的差異性。因此，當(dāng)快速取得Xpert MTB/RIF檢測報告時，要謹慎判讀檢測結(jié)果，最好結(jié)合用藥史或者等待BACTEC MGIT960藥敏檢測結(jié)果再合理調(diào)整治療方案[19]。但BACTEC MGIT960藥敏檢測同XpertMTB/RIF相比較仍耗時較長，不能充分滿足臨床診斷需要，因此，建議有條件的專科醫(yī)院可同時進行MTB-L和結(jié)核RNA檢測。MTB-L培養(yǎng)鑒定需要較長時間，僅能作為最終抗結(jié)核方案調(diào)整依據(jù)，而要快速準(zhǔn)確解讀Xpert MTB/RIF檢測報告意義，同時檢測痰標(biāo)本中結(jié)核RNA是非常理想的方法。目前檢測結(jié)核RNA的新技術(shù)SAT-TB[20]，其技術(shù)原理是以MTB特異的16srRNA為檢測靶標(biāo)，通過恒溫擴增技術(shù)擴增RNA靶標(biāo)片段，對熒光標(biāo)記的探針與靶標(biāo)片段的擴增產(chǎn)物雜交后釋放出熒光信號進行實時檢測得到陽性結(jié)果，從臨床標(biāo)本處理到最終報告結(jié)果僅需幾小時，從而快速準(zhǔn)確地判斷待檢樣本中是否有MTB存在。SAT-TB與基于DNA為模板的核酸擴增技術(shù)如XpertMTB/RIF相比，該技術(shù)只檢測活的MTB，因為MTB死亡后RNA便降解[21]，但DNA存在于活和死亡的MTB中，因此使用SAT-TB技術(shù)檢測RNA能彌補XpertMTB/RIF不能區(qū)別死菌與活菌的缺陷，提高快速準(zhǔn)確診斷能力。

本研究僅統(tǒng)計了兩種方法檢測涂陽痰標(biāo)本的結(jié)果，沒有將涂陰培陽或涂陰培陰標(biāo)本納入，是為了便于對檢測結(jié)果進行客觀分析。因檢測樣本有限，需要更大樣本來驗證相關(guān)數(shù)據(jù)?？傊?，因痰標(biāo)本中MTB存在狀態(tài)可能會導(dǎo)致BACTEC MGIT960及XpertMTB/RIF檢測結(jié)果出現(xiàn)一定差異，關(guān)鍵是對得到的差異結(jié)果進行認真判斷，避免誤診或漏診。

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（收稿日期：2017-09-28 本文編輯：王 娟）endprint