張士發(fā) 邢雪莎 趙麗萍 王艷紅 羅 陽

原發(fā)性皮膚淀粉樣變(Primary Cutaneous Amyloidosis，PCA)是一種慢性皮膚病，以淀粉樣蛋白沉積在既往正常皮膚內(nèi)為主要表現(xiàn)，無其他器官受累。目前已有研究證實(shí)，定位于5p13.1處的抑瘤素M受體(Oncostatin M receptor，OSMR)基因和定位于5q11.2處的IL-31受體A(IL-31RA)基因的突變與PCA相關(guān)[1,2]。我們對(duì)一PCA家系的OSMR基因進(jìn)行了檢測(cè)，進(jìn)一步證實(shí)PCA的致病基因。

1 對(duì)象與方法

1.1 病例資料 先證者III6，女，26歲。8年前背部及四肢出現(xiàn)散在褐色粟粒大斑、丘疹，逐漸密集成片，并向四肢屈側(cè)蔓延，伴有明顯瘙癢。近2個(gè)月病情加重，皮疹逐漸增多，瘙癢明顯，影響睡眠，于2013年1月25日來我院就診。皮膚科情況：背部及四肢伸側(cè)皮膚可見褐色斑及斑丘疹，密集片狀分布，對(duì)稱分布，界限不清，部分融合成串珠狀，部分丘疹表面有少量白色薄屑及少量抓痕(圖1)。體檢：各系統(tǒng)檢查未見異常。實(shí)驗(yàn)室檢查：血、尿常規(guī)，肝、腎功能、血脂、血糖、電解質(zhì)檢查，結(jié)果均正常。心電圖、胸片正常。患者3年前背部皮損病理組織學(xué)檢查顯示：角質(zhì)層角化過度，棘細(xì)胞層略增厚，基底細(xì)胞層液化；真皮乳頭層可見淀粉樣蛋白沉積，有裂隙，其上表皮略薄。真皮淺層少量淋巴細(xì)胞小片狀浸潤及噬黑素細(xì)胞(圖2、3)。甲紫染色陽性(圖4)。臨床診斷：原發(fā)性皮膚淀粉樣變(斑狀)。取得先證者及其家系成員知情同意后對(duì)其家系進(jìn)行調(diào)查。

2 方法

2.1 DNA提取 取得知情同意后，采集家系23個(gè)家系成員外周靜脈血各5 mL，EDTA抗凝，大連寶生物有限公司試劑盒(Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0)提取基因組DNA。

圖1 后背上部可見褐色斑及斑丘疹，部分融合成串珠狀，密集片狀對(duì)稱分布圖2 角質(zhì)層角化過度，角質(zhì)層角化過度，棘細(xì)胞層略增厚(HE，×100)圖3 真皮乳頭層可見淀粉樣蛋白沉積，淺層少量淋巴細(xì)胞小片狀浸潤(HE，×200)圖4 甲紫染色真皮乳頭可見異染性團(tuán)塊狀物質(zhì)沉積(×200)

表1 OSMR引物序列及退火溫度

2.2 PCR擴(kuò)增 以患者基因組DNA為模板，應(yīng)用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增 OSMR基因各外顯子及外顯子內(nèi)含子交接片段。PCR引物序列和退火溫度見表1；PCR反應(yīng)總體積為50 μL，包括2×GC buffer I 25 μL， dNTP(2.5 mmol/L)8 μL，上下游引物(10 pmol/L)各2.5 μL，LA Taq(5U/μL) 0.5 μL，基因組DNA約40 ng，無菌水定容至50 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃ 變性30 sec，退火30 sec，72℃延伸1 min，循環(huán)35次后總延伸72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送生工生物工程(上海)(http：//genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start)股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與UCSC數(shù)據(jù)庫基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，分析樣本是否存在突變情況，此外，通過人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)(www.genecards.org)確定該位點(diǎn)是否為新的突變位點(diǎn)。

3 結(jié)果

3.1 家系調(diào)查 先證者家族3代共有25人，患者4例(I1已故)，先證者及先證者母親、舅舅、外祖父均有類似皮損(圖1)，余家系人員無明顯類似皮損。先證者父母非近親婚配，沒有其他遺傳相關(guān)性疾病。該家系代代發(fā)病，父母雙方正常者，其子女均正常，符合常染色體顯性遺傳方式(圖5)。

圖5 PCA家系圖：25個(gè)家系成員中有4例患者

先證者母親(II5)，女，56歲，皮疹與先證者相似，主要分布于四肢，為原發(fā)性皮膚淀粉樣變(斑狀)，病史27年。先證者舅舅(II1)，男，60歲。雙上肢伸側(cè)及雙小腿脛前可見散在分布淡褐色粟粒至綠豆大丘疹，部分融合成串珠樣，高于皮膚，系原發(fā)性皮膚淀粉樣變(苔蘚樣)，病史33年。先證者外祖父(I1)，已故，有類似皮疹，但病情不詳，不能分型。

3.2 基因突變檢測(cè) 先證者OSMR基因的第15外顯子中檢測(cè)出錯(cuò)義突變c.2081C>T(p.Pro694Leu)(圖6)，其家系中的其他2例患者也攜帶相同的突變位點(diǎn)，而其家系內(nèi)的正常人未見異常。

4 討論

PCA是由一種或多種蛋白質(zhì)與粘多糖結(jié)合而成的蛋白復(fù)合體沉積于血管壁、纖維組織、黏膜和腺體等基底膜及真皮層所致的慢性皮膚病[1,3]，根據(jù)臨床表現(xiàn)可分為苔蘚樣淀粉樣變、斑狀淀粉樣變、原發(fā)性限局性結(jié)節(jié)性皮膚淀粉樣變、結(jié)節(jié)萎縮型皮膚淀粉樣變、皮膚異色病樣淀粉樣變、腰骶骨部皮膚淀粉樣變和摩擦性皮膚淀粉樣變等[4]。本文3例患者也分屬于前2種不同的臨床亞型。

圖6 PCR擴(kuò)增，基因測(cè)序圖，顯示c.2081C>T(p.Pro694Leu)錯(cuò)義突變

2010年，Lin等[2]首次將PCA的染色體突變位點(diǎn)定位于5號(hào)染色體的OSMR基因及IL-31受體A基因。家族性原發(fā)性局限性皮膚淀粉樣變(familial primary localized cutaneous amyloidosis， FPLCA)家系中，致病的雜合子錯(cuò)義突變位于OSMR基因，該基因可編碼OSM特異性受體β亞基[5]和IL-6受體α[6]。OSMR基因和IL-31RA基因分別編碼OSM受體β亞基和IL-31RA，二者可影響Jak/STAT、MAPK和 PI3K/Akt 活性，均屬于IL-6型受體[5]，該受體影響角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化與凋亡，與FPLCA皮損的形成有關(guān)。中國一PLCA家系中先證者OSMR基因的第13位外顯子發(fā)生雜合1845A>T突變[7]。另有報(bào)道29例PCA家系患者IL-31RA 基因上由c.1562C>T點(diǎn)突變所致的致病突變位于OSMR突變中III型纖維蛋白原重復(fù)區(qū)域[2]。目前已報(bào)道的PCA 相關(guān)OSMR基因突變，均為位于OSM受體 β亞基細(xì)胞外III型纖維蛋白控制區(qū)域的錯(cuò)義突變，如p.P694L，p.K697T和p.KD647V位點(diǎn)[1]，以及p.I691T和p.G618A位點(diǎn)[2]。

本家系3例患者顯示出家族遺傳特征：3代25人中4例患者，男、女各2例，發(fā)病年齡18～29歲。遺傳方式和家系基因型分析顯示，該家系3代均有患者，呈垂直連續(xù)遺傳，發(fā)病與性別無關(guān)，夫妻健康者子女不發(fā)病，符合常染色體顯性遺傳方式。該家系3例PCA患者OSMR基因第15號(hào)外顯子均檢測(cè)出c.2081位置C >T錯(cuò)義突變，使氨基酸序列第694號(hào)脯氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼?，而家系?nèi)正常人未檢測(cè)到該突變，與文獻(xiàn)[3,8]報(bào)道相同，說明本家系患者OSMR基因的第15外顯子錯(cuò)義突變與PCA發(fā)病密切相關(guān)。也有報(bào)道色素異常性皮膚淀粉樣變病患者及其家系成員OSMR基因的第14、15外顯子和IL-31RA第12外顯子未發(fā)現(xiàn)突變[9]。一FPCLA家系中所有成員均未發(fā)現(xiàn) OSMR基因突變[10]，提示PCA的不同亞型可能存在遺傳學(xué)上的突變，但本文2種亞型均顯示一種突變。

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