植爽，任艷紅，唐星，徐鳳翔，王傳宏,2，趙愛(ài)春，王茜齡

（1西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400715；2安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230036）

0 引言

【研究意義】桑樹(shù)是最早的栽培林木之一，從海南島到黑龍江，桑樹(shù)有廣泛的分布和利用。長(zhǎng)期以來(lái)，桑樹(shù)都是以養(yǎng)蠶為目的而栽培，其根、皮、枝、葉和富含次生代謝產(chǎn)物的桑果也已被用于保護(hù)肝臟，提高視力，促進(jìn)排尿，改善便秘，降低血壓等[1-3]。此外，桑樹(shù)根系發(fā)達(dá)、耐貧瘠，抗旱、耐鹽堿等抗逆性強(qiáng)[4]。氮代謝在桑樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育、化合物的合成和抗逆過(guò)程中起著重要作用，谷氨酸脫氫酶（GDH）普遍存在于植物中，在碳、氮代謝中既能催化銨與α-酮戊二酸合成谷氨酸，又能催化谷氨酸的氧化同時(shí)釋放銨。目前對(duì)其生理作用的認(rèn)識(shí)還不清楚，因此研究桑樹(shù) GDH的特點(diǎn)對(duì)闡述其生理作用具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】谷氨酸脫氫酶（GDH）曾被認(rèn)為是在高等植物中銨同化的關(guān)鍵酶[5]，自 1974年谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）和谷氨酸合酶(glutamate synthase，GOGAT)被發(fā)現(xiàn)以后，GS/GOGAT循環(huán)被公認(rèn)為高等植物銨同化的關(guān)鍵酶[6]，GDH催化α-酮戊二酸與NH4+合成谷氨酸被認(rèn)為是除GS/GOGAT途徑外的另外一種NH4+同化途徑。此外，GDH存在于線(xiàn)粒體中，GS存在胞質(zhì)中，因此谷氨酸脫氫酶被認(rèn)為對(duì)光呼吸過(guò)程產(chǎn)生的 NH3再同化起著關(guān)鍵作用，但是用GS抑制劑磷絲菌素預(yù)處理或者缺乏GS2或Fd-GOGAT的突變體進(jìn)行試驗(yàn)表明，在光呼吸釋放銨的再同化過(guò)程中，GS2的作用是主要的[7-8]。MASCLAUXDAUBRESSE等[9]通過(guò)15N的銨鹽和谷氨酸示蹤研究證實(shí)，無(wú)論任何葉齡，銨鹽的同化在黑暗和光照的條件下都是經(jīng)過(guò)GS/GOGAT途徑，不依靠GDH途徑，而谷氨酸分解為 α-酮戊二酸和銨鹽的過(guò)程中，GDH在起著重要作用。WANG等[10]研究表明，小麥在低濃度的鹽脅迫下，GS的活性增加，在高濃度的鹽脅迫下，GDH的酶活性增加，GS的酶活性降低。MIYASHITA等報(bào)道[11]擬南芥的兩個(gè) GDH表達(dá)具有組織特異性，受到細(xì)胞內(nèi)碳源調(diào)控，并且認(rèn)為GDH在C缺乏條件下在氨基酸酸降解中起著重要作用。水稻OsGDHs基因家族成員在氮和磷脅迫下表達(dá)量不同[12]。蔗糖饑餓處理會(huì)誘導(dǎo)羽扇豆的GDH酶活性增加，Cd2+和Pb2+導(dǎo)致銨鹽積累，同時(shí)伴隨著 GDH酶活性增加，這些結(jié)果表明GDH主要在逆境條件下在C、N代謝中具有重要功能[13]。近幾年來(lái)，國(guó)內(nèi)外涉及到的研究 GDH的物種越來(lái)越多，也越來(lái)越深入，主要集中在模式植物[14-16]和農(nóng)作物[17-19]中進(jìn)行 GDH 克隆、生物信息學(xué)及表達(dá)分析，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所發(fā)現(xiàn)將真菌的GDH轉(zhuǎn)入到棉花中，可提高氮素利用率30%以上，轉(zhuǎn)GDH植物是屬于抗?fàn)I養(yǎng)貧瘠類(lèi)的新一代轉(zhuǎn)基因植物，它不僅可以節(jié)約氮肥30%—40%，降低生產(chǎn)成本，還有利于環(huán)境保護(hù)[20]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】桑樹(shù)為多年生木本植物，生物產(chǎn)量高，耐肥性強(qiáng)，而GDH在桑樹(shù)中的特點(diǎn)及生物學(xué)功能未見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究擬應(yīng)用RT-PCR技術(shù)克隆MaGDHs，分析其結(jié)構(gòu)和表達(dá)特點(diǎn)，構(gòu)建原核重組表達(dá)載體在大腸桿菌BL21（DE3）中高效表達(dá)，并對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度等參數(shù)進(jìn)行研究和優(yōu)化，建立高效原核表達(dá)體系，為下一步桑樹(shù)的GDH功能研究及其酶促動(dòng)力學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016年3月至2017年5月在西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院桑樹(shù)遺傳育種研究室及家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

取桂桑優(yōu)62號(hào)桑樹(shù)（廣西區(qū)審定的桑樹(shù)雜優(yōu)組合，購(gòu)于廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣總站），屬于廣東桑，將種子消毒后播種于1/2MS培養(yǎng)基上，待其生長(zhǎng)至四葉一心時(shí)，在對(duì)照培養(yǎng)基（MS +瓊脂7 g·L-1+蔗糖30 g·L-1，CK）培養(yǎng)10 d后轉(zhuǎn)移到不同的培養(yǎng)基中（表1），每個(gè)濃度處理4瓶，每瓶3—4株。在不含NH4+的培養(yǎng)基中，硝酸銨用硝酸鉀代替，增加的銨鹽以(NH4)2SO4提供。處理后0、12、24和48 h分別取材。取材時(shí)，每一組試驗(yàn)隨機(jī)采取多株試管苗混合取材，重復(fù)3次。另外，從成熟桑樹(shù)（同一株，雌雄同株不同花穗）中收集根、莖、老葉、嫩葉、幼葉、雌花、雄花、果實(shí)、葉柄、表皮，以檢測(cè)不同組織的轉(zhuǎn)錄水平。收集的所有材料立即在液氮中冷凍帶回實(shí)驗(yàn)室并儲(chǔ)存在-80℃冷凍箱中。

1.2 數(shù)據(jù)搜索和分析

為鑒定桑樹(shù)中GDH基因家族的成員，以“Glutamate dehydrogenase”為關(guān)鍵詞在川桑（Morus notabilis）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://morus.swu.edu.cn/morusdb/）中檢索，并使用 BLASTN（www.ncbi.nlm.nih.gov）和 SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）鑒定候選基因，利用 GeneScript公司在線(xiàn)工具（http://www. genscript.com.cn/index.html）設(shè)計(jì)用于克隆和qRT-PCR的引物（表 2），通過(guò)在線(xiàn)軟件（http://web.expasy.org/compute_pi/）預(yù)測(cè)MaGDHs分子量和等電點(diǎn)。下載可可（Theobroma cacao）、獼猴桃（Actinidia chinensis）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、大豆（Glycine max）、花生（Arachis hypogaea）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、小麥（Triticum aestivum）8個(gè)物種的GDH氨基酸序列，使用Genetyx-v7、Bioxm 26，Sequencher 4.2、BioEdit、GeneDoc等軟件對(duì)GDH基因序列和氨基酸序列進(jìn)行分析和比對(duì)，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)由MEGA 5.0軟件構(gòu)建。

表1 培養(yǎng)基的成分Table 1 Medium ingredients

表2 MaGDH1和MaGDH2的克隆及熒光定量引物序列Table 2 Primers of MaGDH1and MaGDH2 for cloning and qRT-PCR

1.3 RT-PCR克隆MaGDHs

按照TaKaRa公司RNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取桂桑優(yōu)62號(hào)桑葉總RNA。分別取適量體積RNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度。以總 RNA為模板，參照反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(Promega)說(shuō)明書(shū)，并以O(shè)ligo(dT)18作為引物，合成 cDNA第 1鏈，存于-20℃?zhèn)溆?。以cDNA為PCR模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃ 4 min；94℃ 40 s，51℃ 1 min，72℃ 2 min，循環(huán) 32 次；72℃ 10 min。DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，目的片段與TaKaRa公司的PMD19-T載體16℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，挑選陽(yáng)性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.4 MaGDHs的原核表達(dá)及酶活性測(cè)定

本研究使用 pET-28a(+)、pET-32a(+)、pcold-TF載體。設(shè)計(jì)每個(gè)載體含有限制酶位點(diǎn)的引物用于PCR（表3）。將PCR產(chǎn)物克隆到載體中并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21細(xì)胞中以在大腸桿菌細(xì)胞中產(chǎn)生組氨酸標(biāo)記的重組蛋白。分別用 0.1、0.5 和 1.0 mmol·L-1IPTG（異丙基-bD-硫代吡喃半乳糖苷）在大腸桿菌中誘導(dǎo)重組蛋白，pET-28a(+)和 pET-32a(+)載體 28℃培養(yǎng) 6 h，pcold-TF載體在16℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)物4℃下5 000 r/min離心15 min，收集菌體并進(jìn)行超聲破碎，使用不同濃度的咪唑，利用 Ni-NTA親和層析（Genscript，NJ，USA）純化在大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白質(zhì)，用12%（w/v）SDS-PAGE進(jìn)行電泳檢測(cè)。將純化的蛋白質(zhì)用尿素梯度透析液進(jìn)行梯度透析，收集復(fù)性蛋白，用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，用索萊寶公司的谷氨酸脫氫酶試劑盒測(cè)定酶活性，具體方法如下：

酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340 nm，蒸餾水調(diào)零。在試劑二中加入19 ml試劑一充分溶解混勻，25℃水浴5 min，在96孔板中加入10 μL樣本和190 μL試劑二，混勻，立即記錄340 nm處20 s的吸光值A(chǔ)1和5 min后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算△A=A1-A2。定義每毫升復(fù)性的蛋白溶液每分鐘消耗 1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。計(jì)算公式如下：

表3 MaGDH1和MaGDH2原核表達(dá)載體構(gòu)建引物序列Table 3 The primer sequences of prokaryotic expression vectors for MaGDH1 and MaGDH2

1.5 定量PCR分析

分別從收集到的植物材料中提取總RNA。DNase I（TaKaRa，Japan）消化RNA樣品以去除DNA。參照反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(TaKaRa)說(shuō)明書(shū)，以O(shè)ligo(dT)18為引物，合成cDNA第1鏈。將cDNA稀釋3倍，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(2×) 10 μL，ROX Reference Dye(50×) 0.4 μL，cDNA 2 μL，depc H2O 6 μL，上、下游引物各0.8 μL。程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s；94℃ 5 s, 60℃ 30 s, 72℃ 10 min，循環(huán)40次，并以MaACTIN3(HQ163775.1)為內(nèi)參。用 StepOne Software V2.1和GraphPad Prism 5軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用2-△△Ct法進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量分析。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS16進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 桑樹(shù)谷氨酸脫氫酶基因家族的鑒定和克隆

在川桑數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到川桑谷氨酸脫氫酶基因GDH(登錄號(hào)為Morus014749和Morus017087)，以該序列設(shè)計(jì)引物，以栽培桑品種桂桑優(yōu) 62號(hào)的葉片cDNA為模板，通過(guò) RT-PCR，瓊脂糖電泳鑒定出兩條750—1 500 bp的目的條帶（圖1-A）。經(jīng)回收，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)兩條序列全長(zhǎng)均為1 236 bp，編碼411個(gè)氨基酸，含一個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），命名為MaGDH1和MaGDH2。同源比較分析得知，川桑和桂桑優(yōu)62號(hào)的GDH相似性為99%，MaGDH1和MaGDH2氨基酸水平相似度為81%，均含有9個(gè)外顯子，8個(gè)內(nèi)含子（圖1-B）。在線(xiàn)軟件（http://web.expasy.org/compute_pi/）預(yù)測(cè) MaGDH1蛋白質(zhì)的分子量為 44.1 kD，理論等電點(diǎn)為5.84；MaGDH2蛋白質(zhì)的分子量為44.2 kD，理論等電點(diǎn)為6.68。NCBI上分析氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)MaGDH1和MaGDH2蛋白屬于ELFV-dehydrog superfamily超家族。

圖1 MaGDHs瓊脂糖電泳圖(A)及其外顯子內(nèi)含子結(jié)構(gòu)模式圖（B）Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of MaGDHs and their scaled diagram of exon-intron structure

2.2 MaGDHs氨基酸序列比較及進(jìn)化樹(shù)分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載擬南芥、水稻、大豆、可可、獼猴桃等8個(gè)物種的GDH氨基酸序列進(jìn)行同源性分析結(jié)果顯示，MaGDH編碼的氨基酸序列與雙子葉植物中 GDH編碼的氨基酸序列同源性為 86%—93%，與單子葉植物GDH編碼的氨基酸序列同源性為84%—87%。多重序列比對(duì)結(jié)果表明這些GDH所編碼的氨基酸序列含有在N末端的線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移肽序列，包含 Glu/a-KG結(jié)合域的 PF02812結(jié)構(gòu)和包含NAD(P)結(jié)合域的 PF00208結(jié)構(gòu)。PF02812結(jié)構(gòu)比PF00208結(jié)構(gòu)的序列更保守，PF00208結(jié)構(gòu)的 N-和C-端比中間區(qū)域序列更保守（圖2）。同時(shí)利用它們的氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)如圖 3所示，桑樹(shù)的兩個(gè)MaGDHs聚為兩支，驗(yàn)證了克隆的MaGDHs分別為GDH1和 GDH2。MaGDH1與可可先聚為一支，然后與獼猴桃再聚為一支，再與其他雙子葉、單子葉植物聚類(lèi)；MaGDH2并沒(méi)有與可可聚為一類(lèi)，而是可可與獼猴桃先聚為一支，然后與桑樹(shù)再聚為一支，表明 MaGDH1和MaGDH2在進(jìn)化順序上并不是一致的。

2.3 MaGDHs在大腸桿菌BL21（DE3）中原核表達(dá)

以 pET-28a(+)、pET-32a(+)、pCold-TF為載體構(gòu)建融合蛋白重組質(zhì)粒 pET-28a(+)-MaGDH1、pET-32a(+)-MaGDH1、pcold-TF-MaGDH1，pET-28a(+)-MaGDH2、pET-32a(+)-MaGDH2、pcold TF-MaGDH2，酶切電泳如圖4所示，除含有3種質(zhì)粒大小的目的條帶，也含有MaGDH1和MaGDH2片段。以IPTG誘導(dǎo)后，pET-28a(+)-MaGDH1、pET-32a(+)-MaGDH1、pcold-TF-MaGDH1在大腸桿菌 BL21（DE3）中均能表達(dá)，且使用pET-28a(+)載體時(shí)以IPTG濃度為0.1 mmol·L-1表達(dá)效果最佳，pET-32a(+)載體時(shí) IPTG 濃度為 1.0 mmol·L-1效果最佳，pCold-TF載體時(shí) IPTG濃度對(duì)蛋白表達(dá)量影響不大（圖5-A、B、C）。MaGDH2只能以重組質(zhì)粒pET-32a(+)-MaGDH2才能在大腸桿菌 BL21（DE3）中成功表達(dá)，IPTG 濃度為 1.0 mmol·L-1時(shí)效果最佳(圖 5-D、E、F)。融合蛋白 pET-28a(+)-MaGDH1，pCold-TF-MaGDH1大小接近44.3 kD，與預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致，pET-32a(+)自帶標(biāo)簽大于pET-28a(+)和pCold-TF，因而融合蛋白pET-32a(+)-MaGDH1、pET-32a(+)-MaGDH2大小接近66.4 kD。將菌液進(jìn)行超聲破碎，將上清和沉淀分別進(jìn)行 SDSPAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果表明 pET-28a(+)-MaGDH1、pET-32a(+)-MaGDH1、pCold-TF-MaGDH1和pET-32a(+)-MaGDH2均以包涵體的形式存在（圖5-G、H）。

2.4 MaGDHs蛋白的純化及酶活性測(cè)定

用 Ni-NTA樹(shù)脂層析柱，利用不同濃度的咪唑洗滌蛋白沉淀，對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化SDS-PAGE電泳表明，pET-28a(+)-MaGDH1、pET-32a(+)-MaGDH1和pCold-TF-MaGDH1均在咪唑濃度為100 mmol·L-1時(shí)目的蛋白被大量洗脫下來(lái)（圖6-A、B、C），而pET-32a(+)-MaGDH2目的蛋白則在咪唑濃度為250 mmol·L-1時(shí)被大量洗脫下來(lái)(圖 6-D)，獲得純化的MaGDH1蛋白和 MaGDH2蛋白。經(jīng)過(guò)測(cè)定，不同載體重組質(zhì)粒在最適 IPTG濃度條件下，表達(dá)的蛋白質(zhì)含量不同(表4)，活性也有差異，其中pCold-TFMaGDH1 表達(dá)的蛋白最高，為 633.6 μg·mL-1，但表達(dá)的蛋白沒(méi)有酶活性，而 pET-28a(+)-MaGDH1表達(dá)的蛋白活性最高，為 10.07 nmol-1·min-1·mL-1。

圖2 桑樹(shù)谷氨酸脫氫酶GDH的氨基酸與其他物種氨基酸序列同源性序列比對(duì)Fig. 2 Amino acid sequence alignment of glutamate dehydrogenase (GDH) mulberry and other species

圖3 GDH家族的系統(tǒng)樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree of the glutamate dehydrogenase family

圖4 重組質(zhì)粒的酶切電泳Fig. 4 Electrophoresis of recombinant plasmid after restriction digestion

2.5 MaGDH1和MaGDH2的組織表達(dá)

MaGDH1和MaGDH2在桑樹(shù)各個(gè)組織中都有表達(dá)（圖7），總體上MaGDH1在各個(gè)組織上表達(dá)量高于MaGDH2。MaGDH1在雄花中的表達(dá)量最高，其次為嫩葉、莖、葉柄、雌花，在果實(shí)中表達(dá)量低。MaGDH2也是在雄花中的表達(dá)量最高，其次為雌花、幼葉、嫩葉、莖、葉柄，在果實(shí)中幾乎不表達(dá)。桑樹(shù)的開(kāi)花期在花和幼葉代謝生長(zhǎng)發(fā)育旺盛，莖和葉柄起運(yùn)輸作用，由此推測(cè)，MaGDH1和MaGDH2在各個(gè)組織中的表達(dá)量與桑樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。

2.6 MaGDH1和MaGDH2的表達(dá)的調(diào)控

在培養(yǎng)基中添加 10、20和 30 g·L-1的蔗糖，MaGDH1和MaGDH2的表達(dá)量如圖8所示。隨著蔗糖濃度的增加，MaGDH1和MaGDH2表達(dá)量增加，MaGDH1在蔗糖濃度為30 g·L-1處理12 h時(shí)表達(dá)量最高，MaGDH2則在蔗糖濃度為30 g·L-1處理24 h時(shí)表達(dá)量最高，MaGDH2的相對(duì)表達(dá)量比MaGDH1表達(dá)量高。MaGDHs受NH4+調(diào)控表達(dá)如圖9所示，培養(yǎng)基中即使沒(méi)有外源NH4+，MaGDHs也有表達(dá)，添加20 mmol·L-1（常規(guī)量）NH4+時(shí)，MaGDHs表達(dá)量立即增加；當(dāng)NH4+增加到30 mmol·L-1（過(guò)量）時(shí)，MaGDHs并沒(méi)有立即增加反而受到抑制，MaGDH1在24 h表達(dá)量超過(guò)常規(guī)NH4+濃度的表達(dá)量，MaGDH2在48 h表達(dá)量超過(guò)常規(guī)NH4+濃度的表達(dá)量。在培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素6-BA，MaGDH1和MaGDH2的表達(dá)量如圖10所示，添加6-BA 12 h后，MaGDH1和MaGDH2的表達(dá)量都受到抑制，濃度越高，抑制更加明顯；24 h后，MaGDH1的表達(dá)量受到濃度為1.0 mg·L-1和2 mg·L-1的6-BA促進(jìn)，當(dāng)濃度為3 mg·L-1時(shí)抑制其表達(dá)；48 h時(shí)，3個(gè)濃度的6-BA都促進(jìn)MaGDH2的表達(dá)。

圖5 原核表達(dá)MaGDHs蛋白表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳(箭頭所指為目的蛋白)Fig. 5 SDS-PAGE electrophoresis of MaGDHs fusion protein product by prokaryotic expression (The arrow refers to the target protein strip)

圖6 重組MaGDHs蛋白的純化Fig. 6 Purification of recombinant MaGDHs fusion protein

表4 MaGDHs重組蛋白含量及酶活性Table 4 The content and activity of MaGDHs protein

圖7 MaGDHs在各個(gè)組織中定量表達(dá)分析Fig. 7 Quantitative real-time PCR (qPCR) results for MaGDHs genes

3 討論

一般認(rèn)為，高等植物GDH中的α和β亞基分別由不同的兩個(gè)基因編碼，GDH1（或 GDHB）基因編碼β亞基，GDH2(或GDHA)編碼α亞基[21]，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了GDH3編碼γ亞基[22]。在有些植物中如黑小麥、黃羽扇豆、煙草、番茄等已克隆出了至少2個(gè)GDH，分別編碼α和β亞基[23-26]，而一些植物中目前卻只克隆獲得了其中一個(gè)基因[27-29]。本研究結(jié)果表明，桑樹(shù)中有兩個(gè)GDH，進(jìn)化樹(shù)分析表明MaGDHs蛋白屬于兩種類(lèi)型，分別為MaGDH1和MaGDH2，分別編碼β亞基和α亞基。

圖8 MaGDHs在不同濃度蔗糖條件下定量表達(dá)Fig. 8 Quantitative real-time PCR (qPCR) results for MaGDHs genes under different concentration of sucrose

LEHMANN等[24]報(bào)道黃羽扇豆GDH1和GDH2的表達(dá)具有組織特異性，雖然兩個(gè)基因在黃羽扇豆的所有組織中都有表達(dá)，但GDH1的轉(zhuǎn)錄明顯高于GDH2，本研究的結(jié)果與其結(jié)果基本一致。此外，在檢測(cè)的桑樹(shù)組織中，MaGDH1和 MaGDH2均在花中表達(dá)量最高，與前人對(duì)水稻[12]和擬南芥[30]GDH的研究結(jié)果相似，他們認(rèn)為花器官是能量需求較多的器官，因此AtGDH2和OsGDH2在花中表達(dá)量最高。谷氨酸脫氫酶的生理功能有較多的爭(zhēng)論，由于植物體內(nèi)的 GDH對(duì)于銨具有很高的 Km值（5.2—70 mmol·L-1），使人們對(duì)于GDH在植物體內(nèi)的銨同化功能提出質(zhì)疑。也有人認(rèn)為GDH的底物是NH3而不是NH4+，本研究在未加外源NH4+的情況下，檢測(cè)到GDH的表達(dá)，因此推測(cè)，GDH底物至少不會(huì)完全來(lái)源于外源NH4+也可能由植物自身代謝產(chǎn)生。本研究表明添加過(guò)量的NH4+能促進(jìn)MaGDHs表達(dá)，且MaGDH1與響應(yīng)比MaGDH2早，結(jié)果暗示MaGDHs可能對(duì)過(guò)量的 NH4+有一定的解毒作用。FOX等[31]以胡蘿卜懸浮細(xì)胞為材料發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中碳源缺乏時(shí)GDH活性最大，當(dāng)給培養(yǎng)基添加蔗糖時(shí)，GDH活性急劇降低；MELO-OLIVEIRA[32]以擬南芥為材料，發(fā)現(xiàn)在黑暗或碳源有限供給條件下，GDH1的mRNA大量積累，而光照條件或蔗糖供給都會(huì)抑制GDH1 mRNA積累，本研究發(fā)現(xiàn)隨著蔗糖濃度增加，MaGDH1和 MaGDH2的表達(dá)量增加，因此，碳源對(duì) MaGDHs的調(diào)控還有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，MaGDHs還受到外源激素的調(diào)控，培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素6-BA 12 h后，抑制了MaGDH1和MaGDH2的表達(dá)，并且濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，這種抑制作用減弱，推測(cè) 6-BA對(duì)MaGDHs的正調(diào)控可能是間接調(diào)控。

圖9 MaGDHs在不同濃度NH4條件下定量表達(dá)Fig. 9 Quantitative real-time PCR (qPCR) results for MaGDHs genes under different concentration of NH4+

圖10 MaGDHs在不同濃度6-BA條件下定量表達(dá)Fig. 10 Quantitative real-time PCR (qPCR) results for MaGDHs genes under different concentration of 6-BA

4 結(jié)論

獲得兩個(gè)MaGDHs，全長(zhǎng)均為1 236 bp，編碼411個(gè)氨基酸，分別編碼β和α亞基，基因序列高度保守。MaGDHs表達(dá)具有組織特異性，在旺盛生長(zhǎng)的組織中表達(dá)量較高，受到過(guò)量NH4+、細(xì)胞分裂素的調(diào)控。IPTG濃度和載體都會(huì)影響重組蛋白的高效表達(dá)，大腸桿菌表達(dá)的重組MaGDH蛋白以包涵體形式存在，不同載體的重組蛋白酶活性存在差異。

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