王菲，李顯揚，化曉婷，夏慶友

（西南大學家蠶基因組生物學國家重點實驗室，重慶400716）

0 引言

【研究意義】家蠶（Bombyx mori）既是絹絲產(chǎn)業(yè)的支柱，也是鱗翅目昆蟲的模式生物，同時還是高效生物反應(yīng)器的開發(fā)主體，其潛在價值的不斷挖掘與研究具有重要的產(chǎn)業(yè)價值及科學意義。家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）是導(dǎo)致蠶業(yè)重大損失的主要病原體之一，因此研究家蠶的抗BmNPV免疫機制，解析抗病毒免疫信號通路，篩選和鑒定抗病毒分子，不僅可以為開發(fā)抗病優(yōu)良品種提供靶標和依據(jù)，也將完善昆蟲抗病毒免疫的理論體系?！厩叭搜芯窟M展】對昆蟲抗病毒免疫應(yīng)答的研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲通常采用包括RNAi、細胞凋亡、細胞自噬、抑制病毒復(fù)制和蛋白質(zhì)合成等機制予以防御[1-3]，但這些機制主要在細胞內(nèi)部，較少涉及到細胞之間的“交流”。已知病毒感染哺乳動物細胞后，可以激活NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，從而誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生并分泌包括干擾素（interferon，IFN）在內(nèi)的多種細胞因子[4]。干擾素通過擴散到周邊或隨循環(huán)系統(tǒng)運至機體各部位，結(jié)合細胞表面受體激活下游信號通路，進而誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生諸如能降解病毒核酸或抑制病毒基因表達的效應(yīng)蛋白，增強細胞的抗病毒能力。雖然通過同源比對，在昆蟲基因組中未檢索到IFN的同源分子，但近年來在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）和庫蚊（Culex）中鑒定到了一種可能發(fā)揮類似于IFN的作用的抗病毒因子Vago[5-6]。Vago為分泌型蛋白質(zhì)，其表達受到病毒感染的誘導(dǎo)，能激活未被病毒感染的細胞中的Jak-STAT信號通路并誘導(dǎo)這些細胞表達抗病毒基因vir-1（virus-induced RNA 1）從而控制病毒的擴散。Vago基因啟動子上有NF-κB類轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，并且 NF-κB類轉(zhuǎn)錄因子 Relish（在庫蚊中被命名為Rel2）被證實參與Vago的誘導(dǎo)表達[7]。Relish的N端具有轉(zhuǎn)錄因子活性的Rel同源結(jié)構(gòu)域（Rel homology domain，RHD），C端具有將其錨定于細胞質(zhì)的Ankyrin重復(fù)序列（ANK）。當其活化時，C端ANK被切除，N端暴露出核定位信號從而進入細胞核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用[8]。果蠅 relish突變個體在感染蟋蟀麻痹病毒（Cricket Paralysis virus，CrPV）或辛德比斯病毒（Sindbis virus，SINV）后，體內(nèi)病毒載量遠高于正常個體，死亡率升高，說明Relish參與抗病毒免疫；在埃及伊蚊（Aedes aegypti）細胞中還觀測到，SINV感染導(dǎo)致Relish的活化[9-10]。而BmRelish通常認為參與抗菌肽表達的調(diào)控，在對抗細菌或真菌感染的免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用[11-12]，但通過轉(zhuǎn)錄組測序或全基因組表達譜芯片等方法對家蠶個體或細胞進行檢測，發(fā)現(xiàn)BmNPV感染并未導(dǎo)致BmRelish表達水平的明顯變化[13-15]?？紤]到mRNA水平（表達水平）的變化可能并不能完全反映其蛋白質(zhì)水平（活性）的變化，且家蠶細胞在感染BmNPV后，gloverin、lebocin、attacin等抗菌肽基因轉(zhuǎn)錄水平升高[13]，而抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄通常被認為是受到NF-κB類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[16]，由此推測BmNPV感染可能導(dǎo)致BmRelish的活化。【本研究切入點】目前，對家蠶細胞被BmNPV病毒感染后是否產(chǎn)生并分泌抗病毒因子還未有相關(guān)研究；對BmRelish是否被BmNPV感染所激活也無直接證據(jù)；并且抗病毒因子的產(chǎn)生是否受到 BmRelish的調(diào)控更缺乏探索?！緮M解決的關(guān)鍵問題】針對以上問題，本研究首先檢測BmNPV感染是否導(dǎo)致BmRelish活化以及BmRelish是否調(diào)控抗病毒免疫；然后通過在細胞中表達具有轉(zhuǎn)錄活性的BmRelish，利用Transwell細胞共培養(yǎng)等方法確定細胞是否產(chǎn)生并分泌具有抗病毒活性的細胞因子；再通過超濾初步分級分離抗病毒因子并予以質(zhì)譜分析，為后續(xù)鑒定和功能性研究抗病毒因子提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2015年9月至2017年4月在西南大學家蠶基因組生物學國家重點實驗室完成。

1.1 材料與主要試劑

試驗所用家蠶胚胎細胞系 BmE[17]以及感染細胞所需BmNPV，均由筆者實驗室保存；BmNPV-EGFP由浙江大學吳小鋒教授饋贈；帶有 Myc標簽的BmRelish-FL和BmRelishact真核表達載體pSLfa1180-Myc-BmRelish-FL，pSLfa1180-Myc-BmRelishact由筆者實驗室構(gòu)建[18]。

GAPDH抗體、HRP標記山羊抗小鼠抗體、RIPA細胞裂解液、彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標準均購自碧云天公司；Myc標簽抗體和C18 Cartridge購自Sigma公司；細胞轉(zhuǎn)染試劑購自Roche公司；Grace昆蟲細胞培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Gibco公司；ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購自 Thermo公司；基因組提取試劑盒和熒光定量PCR相關(guān)試劑購自TaKaRa公司；3、10 kD超濾管和Transwell小室購自Merck Millipore。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染和Western blot檢測

27℃條件下，用含10%胎牛血清的Grace昆蟲細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)BmE細胞。轉(zhuǎn)染前24 h，將細胞接種至12孔板中（1×105個細胞/孔），按照轉(zhuǎn)染試劑操作說明轉(zhuǎn)染 1 μg pSLfa1180-Myc-BmRelish-FL或pSLfa1180-Myc-BmRelishact質(zhì)粒DNA。轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞用于Western blot檢測。

用細胞裂解液裂解細胞后提取總蛋白，采用BCA蛋白濃度測定法測定蛋白濃度，按等量上樣進行12%SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉1 h后，用Myc抗體或GAPDH抗體室溫孵育1 h，TBST清洗3次后用二抗室溫孵育1 h，再用TBST清洗5次，最后用ECL化學發(fā)光檢測試劑進行顯色反應(yīng)。

1.3 熒光定量PCR檢測病毒拷貝數(shù)

使用TCID50法測定病毒滴度。將病毒和培養(yǎng)基充分混勻后添加到12孔板中（105PFU病毒/孔），在感染后不同時間點收集細胞，提取基因組。熒光定量PCR采用相對定量法，以 BmNPV-gp64為目標基因，以Bmgapdh為參比基因，引物序列見表1。擴增程序為95℃ 3 s，60℃ 30 s，共40 個循環(huán)。在退火/延伸階段進行熒光信號數(shù)據(jù)采集，最后對熔解曲線進行分析。依據(jù)各樣品中的目標基因和內(nèi)參基因的臨界循環(huán)數(shù)（Ct）值，利用 2-△△Ct計算分析。所有的數(shù)據(jù)均采用平均值±標準偏差（SD）表示，數(shù)據(jù)顯著性分析部分采用Student’s t檢驗，P＜0.05具有顯著性差異，P＜0.01具有極顯著性差異。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 Transwell細胞共培養(yǎng)實驗

轉(zhuǎn)染48 h后，在表達BmRelishact的細胞培養(yǎng)板內(nèi)放置接種有新鮮BmE細胞的Transwell小室（1×105個細胞/小室），共培養(yǎng)6 h后在每個小室內(nèi)加入105PFU病毒，在感染24、48和72 h后收集小室中的細胞，進行熒光定量PCR檢測病毒拷貝數(shù)，試驗重復(fù)3次。

1.5 抗病毒活性物質(zhì)的超濾篩選

轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞上清培養(yǎng)液，使用3或10 kD的超濾管進行超濾離心。將截留液和濾過液分別與完全培養(yǎng)基混勻后添加到新鮮接種的細胞中，培養(yǎng) 6 h后在每個細胞培養(yǎng)孔內(nèi)加入105PFU病毒，感染48或96 h后收集細胞檢測病毒拷貝數(shù)。

1.6 質(zhì)譜檢測

為避免培養(yǎng)基內(nèi)的血清、水解乳蛋白等干擾，在轉(zhuǎn)染細胞6 h將培養(yǎng)基換成不含血清、水解乳蛋白、抗生素的Grace培養(yǎng)基，8 h后收集細胞上清，用10 kD超濾管超濾濃縮，所得濾液再用3 kD超濾管超濾，收集濾過液。采用C18 Cartridge對樣本進行脫鹽，樣品凍干后加入 40 μL 0.1%甲酸溶液復(fù)溶，肽段定量（OD280）。按照定量結(jié)果取3 μL樣本進行LC-MS/MS分析。采用納升級流速HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進行分離。肽段經(jīng)色譜分離后使用 Q-Exactive 質(zhì)譜儀（Thermo Scientific）進行質(zhì)譜分析。分析時長：120 min；檢測方式：正離子；母離子掃描范圍：300—1 800 m/z；一級質(zhì)譜分辨率：70 000 at m/z 200；一級Maximum IT：50 ms。多肽和多肽的碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描后采集20個碎片圖譜（MS2 scan），二級質(zhì)譜分辨率：17 500 at m/z 200；Microscans：1；Isolation window：2 m/z；二級 Maximum IT：60 ms；MS2 Activation Type：HCD；Normalized collision energy：27 eV；Dynamic exclusion：60.0 s；Underfillratio：0.1%。原始文件通過 Proteome Discoverver軟件采用Mascot 2.2進行數(shù)據(jù)庫檢索，數(shù)據(jù)庫為SilkDB（http://silkworm.swu.edu.cn/silkdb/）與NCBI收錄的家蠶數(shù)據(jù)。

1.7 質(zhì)譜檢測結(jié)果數(shù)據(jù)分析

利用Blast2Go軟件對質(zhì)譜鑒定到的蛋白進行功能注釋，并且利用BGI WEGO（http://wego.genomics.org.cn/cgi-bin/wego/index.pl）進行數(shù)據(jù)解析及GO注釋圖型化制作；利用 ExPASy（http://web.expasy.org/compute_pi/）預(yù)測蛋白分子量大小；利用 SMART（http://smart.embl-heidelberg.de）預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)域；利用 WoLF PSORT（http://www.genscript.com/wolfpsort.html）對預(yù)測蛋白亞細胞定位。

2 結(jié)果

2.1 BmRelish調(diào)節(jié)抗病毒免疫

為探究BmRelish的活化是否受到BmNPV感染的誘導(dǎo)，在 BmE細胞中轉(zhuǎn)染并表達 BmRelish-FL（BmRelish全長形式），經(jīng)BmNPV感染后，檢測是否產(chǎn)生其活性形式 BmRelishact。結(jié)果表明，BmRelish-FL在病毒感染后部分轉(zhuǎn)變成BmRelishact（圖1-A），暗示病毒感染導(dǎo)致了BmRelish的活化。

為探究BmRelish活化后是否參與抗病毒免疫，用BmNPV或 BmNPV-EGFP感染過表達 BmRelishact的BmE細胞，并通過qPCR檢測病毒DNA在細胞內(nèi)的相對水平或通過顯微鏡觀測呈現(xiàn)EGFP熒光的細胞。結(jié)果顯示，過表達BmRelishact的細胞中，病毒DNA的相對水平顯著低于作為對照的未表達BmRelishact的細胞（圖1-B），且其中呈現(xiàn)EGFP熒光的細胞數(shù)，即病毒得以復(fù)制的細胞數(shù)也明顯較對照細胞少（圖1-C）。這一結(jié)果說明BmRelishact的表達促進了抗病毒免疫。

圖1 BmRelish的Western blot檢測及細胞表達BmRelishact后抗病毒免疫水平的定量檢測Fig. 1 Western blot detection of BmRelish and quantitative analysis of the antiviral immunity of BmRelishact-expressing cells

2.2 BmRelishact促進細胞產(chǎn)生分泌型抗病毒因子

BmRelishact作為轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄。為探究這些基因是否編碼具有增強細胞抗病毒能力的蛋白質(zhì)，尤其是分泌型抗病毒因子，采用Transwell細胞共培養(yǎng)實驗對過表達 BmRelishact的細胞上清培養(yǎng)液予以了檢測。結(jié)果顯示，若下室為過表達 BmRelishact的細胞，則其上室細胞在感染BmNPV后，細胞中病毒DNA的相對水平在各檢測時間點均明顯降低（圖2-A）。

為進一步確定過表達BmRelishact的細胞上清培養(yǎng)液中存在抗病毒因子，收集上清用于孵育新鮮細胞，在感染BmNPV 24、48和96 h后檢測病毒DNA在細胞內(nèi)的相對水平。結(jié)果顯示，經(jīng)過表達BmRelishact的細胞上清培養(yǎng)液孵育后，待測細胞中病毒 DNA的相對水平顯著低于對照（圖2-B）。

上述結(jié)果表明當BmRelishact在細胞中表達后，細胞產(chǎn)生并向胞外分泌了具有抗病毒活性的物質(zhì)。

圖2 表達BmRelishact的細胞培養(yǎng)液抗病毒活性的定量檢測Fig. 2 Quantitative analysis of the antiviral activity of supernatant medium of BmRelishact-expressing cells

2.3 抗病毒因子的分級鑒定

為了進一步確定抗病毒因子的性質(zhì)，采用超濾法對其分子量大小進行了鑒定。結(jié)果顯示，細胞上清培養(yǎng)液經(jīng)100 kD超濾管處理后的濾過液能增強細胞的抗病毒免疫，而截留液則無此活性（圖 3-A），由此推測該抗病毒因子分子量可能＜100 kD。經(jīng)3 kD超濾管處理后的濾過液依然能增強細胞的抗病毒免疫，而截留液則無此活性（圖 3-B）。結(jié)果說明抗病毒因子的分子量應(yīng)該也＜3 kD。

鑒于分子量＜3 kD的物質(zhì)有可能為核酸、多肽或者小分子化學物質(zhì)，故使用高溫處理這種最直觀的方法對其屬性進行了分析。小片段核酸和化學小分子具有一定的耐高溫性，而多肽則可能因高溫處理而失活。結(jié)果表明，濾過液經(jīng)加熱處理后無促進細胞抗病毒能力的活性（圖 3-C）。由此推測抗病毒因子可能為對高溫敏感的多肽，而非核酸或者小分子化合物。

2.4 抗病毒因子的質(zhì)譜鑒定和分析

對經(jīng)3 kD超濾管處理后的濾過液進行質(zhì)譜檢測，共鑒定出了67個肽段，肽段長度為9—45個氨基酸，富集到32個蛋白質(zhì)（表2），其中分子量＞100 kD的蛋白有9個，分子量為50—100 kD的蛋白有9個，分子量在20—50 kD的蛋白有10個，分子量＜20 kD的蛋白有4個，但是并沒有分子量＜3 kD的蛋白。由此推測該抗病毒細胞因子可能是由某些分子量較大的蛋白質(zhì)經(jīng)酶解所產(chǎn)生的小肽。

對鑒定到的所有蛋白進行結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，9個蛋白質(zhì)具有信號肽（表3）。其中XP_021208710.1還具有 Chorion_1結(jié)構(gòu)域，BGIBMGA000185-PA和XP_021204595.1還具有 Chitin_bind結(jié)構(gòu)域，BGIBMGA010888-PA還具有糖原脫支酶（GDE）相關(guān)結(jié)構(gòu)域，XP_021208146.1還具有EGF和CUB等結(jié)構(gòu)域。

圖3 表達BmRelishact的細胞培養(yǎng)液經(jīng)超濾處理后抗病毒活性的定量檢測Fig. 3 Quantitative analysis of the antiviral activity of supernatant medium of BmRelishact-expressing cells after fractionation by ultrafiltration

表2 細胞上清培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定Table 2 Proteins in cell culture supernatant identified by LC-MS

續(xù)表2 Continued table 2

表3 有信號肽的蛋白質(zhì)Table 3 Proteins containing signal peptide

3 討論

昆蟲依賴于其先天免疫系統(tǒng)抵御病原微生物的感染。在家蠶和其他一些鱗翅目昆蟲的腸液、血淋巴等組織液中鑒定了多種具有抗 NPV活性的蛋白質(zhì)，如lipase-1、alkaline trypsin、hemolin等；將病毒與這些蛋白質(zhì)孵育后再感染昆蟲宿主，宿主的死亡率降低[19-21]。通過比較BmNPV易感和抗性家蠶品系的基因表達差異，也發(fā)現(xiàn)了不少可能參與抗BmNPV免疫應(yīng)答的基因，例如BmSP-2、BmAquaporin、BmCTP1、BmGRP4等[22-25]。但這些分子均未涉及細胞之間的相互作用和抗病毒免疫應(yīng)答的協(xié)同調(diào)控。本研究從BmNPV感染所激活的轉(zhuǎn)錄因子BmRelish出發(fā)，鑒定受BmRelish調(diào)控的抗病毒細胞因子，探索家蠶抗病毒免疫的新機制。

從昆蟲到哺乳動物，NF-κB轉(zhuǎn)錄因子在免疫應(yīng)答中都發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。在哺乳動物中，多種模式識別受體（pattern-recognition receptors，PRRs），如RIG-I-like受體或TLR等結(jié)合病毒核酸分子，開啟信號通路激活NF-κB轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)控IFN等細胞因子的表達[26]。在昆蟲中，NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的激活通常被認為是受到細菌或真菌感染的誘導(dǎo)：免疫信號通過兩條經(jīng)典的通路——Toll和 IMD信號通路傳遞至NF-κB類轉(zhuǎn)錄因子，Dorsal/Dif或Relish，并由此啟動包括抗菌肽等多種免疫效應(yīng)分子的表達[16]。而昆蟲細胞被病毒感染后，Dicer-2結(jié)合病毒dsRNA并將其切割成小的干涉RNAs（small interfering RNAs），通過RNAi方式進行防御[27]。Dicer-2和RIG-I-like受體具有相似的 DExD/H-box解旋酶結(jié)構(gòu)域，功能類似[5]；但Dicer-2是否參與了昆蟲細胞NF-κB類轉(zhuǎn)錄因子的激活，仍未可知。

雖然就昆蟲中是否存在抗病毒細胞因子還存在爭議，但不少研究都先后報道了昆蟲細胞被病毒感染后產(chǎn)生參與抗病毒免疫應(yīng)答的分泌型蛋白質(zhì)或多肽。例如果蠅抗菌肽基因 attacinC和 diptericinB 的表達受SINV感染的誘導(dǎo)，用 dsRNA降低 attacinC和diptericinB的表達水平后，果蠅個體中 SINV的復(fù)制水平升高[28]。伊蚊細胞被DENV感染后，分泌具有抗病毒活性的Cecropin-like小肽，其分子量僅為3.8 kD；用該多肽孵育細胞后，胞內(nèi)病毒 RNA水平降低[29]。而且，從被DENV感染的伊蚊細胞上清培養(yǎng)液中還鑒定到幾種帶負電荷的7肽，不僅能降低伊蚊細胞中的病毒載量還能增強猴腎細胞的抗病毒能力[30-31]。本研究所篩選的抗病毒細胞因子，分子量同樣較?。ǎ? kD），且通過質(zhì)譜分析推測這些抗病毒因子是由分子量較大的蛋白質(zhì)酶解所產(chǎn)生的。事實上，這種由前體蛋白剪切成具有生物活性的小肽，在昆蟲中屢見報道，其中最為典型的是鱗翅目昆蟲ENF肽家族成員。這些由23或25個氨基酸組成的多肽，是由無活性的前體經(jīng)由血淋巴中的絲氨酸蛋白酶剪切所生成的，同樣發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫功能的作用[32-34]。

細胞因子結(jié)合細胞表面受體從而開啟效應(yīng)蛋白的表達。在哺乳動物中，IFN與其受體結(jié)合后，通過Jak-STAT信號通路調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[35]。果蠅和蚊類中鑒定到的 Vago，通過細胞表面未知受體同樣激活Jak-STAT信號通路。鑒于Jak-STAT在物種間的保守性，家蠶抗病毒細胞因子也可能激活 Jak-STAT信號通路而發(fā)揮作用。事實上，通過基因芯片也檢測到家蠶Jak和STAT在病毒感染后表達量的變化[14,36]。但家蠶基因組中并不存在vir-1同源基因，因此確認家蠶細胞 Jak-STAT信號通路是否被激活，可能需要通過檢測受 Jak-STAT信號通路調(diào)控的其他效應(yīng)基因，例如Socs36E的表達來實現(xiàn)[37]。

通過質(zhì)譜鑒定到 9個具有信號肽的蛋白質(zhì)，推測這些蛋白或者分泌到細胞外或者以跨膜蛋白的方式存在于細胞膜上。其中Attractin-like蛋白被報道能刺激T細胞和巨噬細胞活化和黏附，參與對HIV的防御過程[38]。其余蛋白雖然不具有信號肽，但并不能排除其自身或經(jīng)酶切后的產(chǎn)物經(jīng)其他蛋白轉(zhuǎn)運途徑分泌到細胞外，例如Hsp70（heat shock protein 70，BGIBMGA014618-PA）通過囊泡運輸?shù)郊毎?，激活多個免疫信號通路[39-40]，且BmNPV感染6 h后在家蠶腸液中也檢測到了Hsp70及其家族成員，但其受BmNPV誘導(dǎo)表達的機制還不明確[41]。為縮小候選多肽數(shù)量便于后續(xù)檢測，對細胞上清培養(yǎng)液還需要通過其他方法進一步分級分離，比如利用離子交換柱予以分離，或聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)進行分析。

4 結(jié)論

BmNPV感染導(dǎo)致 BmRelish的激活，活化的BmRelish通過調(diào)控抗病毒細胞因子的表達參與抗病毒免疫。存在于表達BmRelish活化形式的細胞上清培養(yǎng)液中的細胞因子，為分子量＜3 kD的多肽。

[1] KINGSOLVER M B, HUANG Z, HARDY R W. Insect antiviral innate immunity: pathways, effectors, and connections. Journal of Molecular Biology, 2013, 425: 4921-4936.

[2] XU J, GRANT G, SABIN L R, GORDESKY-GOLD B, YASUNAGA A, TUDOR M, CHERRY S. Transcriptional pausing controls a rapid antiviral innate immune response in Drosophila. Cell Host & Microbe,2012, 12: 531-543.

[3] LIU B, BEHURA S K, CLEM R J, SCHNEEMANN A, BECNEL J,SEVERSON D W, ZHOU L. P53-mediated rapid induction of apoptosis conveys resistance to viral infection in Drosophila melanogaster. PLoS Pathogens, 2013, 9(2): e1003137.

[4] YAN N, CHEN Z J. Intrinsic antiviral immunity. Nature Immunology,2013, 13(3): 214-222.

[5] DEDDOUCHE S, MATT N, BUDD A, MUELLER S, KEMP C,GALIANA-ARNOUX D, DOSTERT C, ANTONIEWSKI C,HOFFMANN J A, IMLER J L. The DExD/H-box helicase Dicer-2 mediates the induction of antiviral activity in Drosophila. Nature Immunology, 2008, 9(12): 1425-1432.

[6] PARADKAR P N, TRINIDAD L, VOYSEY R, DUCHEMIN J B,WALKER P J. Secreted Vago restricts West Nile virus infection in Culex mosquito cells by activating the Jak-STAT pathway.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109(46): 18915-18920.

[7] PARADKAR P N, DUNCHEMIN J B, VOYSEY R, WALKER P J.Dicer-2-dependent activation of Culex Vago occurs via the TRAF-Rel2 signaling pathway. PLoS Neglected Tropical Diseases,2014, 8(4): e2823.

[8] SILVERMAN N, MANIATIS T. NF-κB signaling pathways in mammalian and insect innate immunity. Genes & Development, 2001,15(18): 2321-2342.

[9] COSTA A, JAN E, SARNOW P, SCHNEIDER D. The IMD pathway is involved in antiviral immune response in Drosophila. PLoS One,2009, 4(10): e7436.

[10] AVADHANULA V, WEASNER B P, HARDY G G, KUMAR J P,HARDY R W. A novel system for the launch of alphavirus RNA synthesis reveals a role for the IMD pathway in anthropd antiviral response. PLoS Pathogens, 2009, 5(9): e1000582.

[11] HOFFMANN J A, REICHHART J M. Drosophila innate immunity:an evolutionary perspective. Nature Immunology, 2002, 3(2): 121-126.

[12] TANAKA H, MATSUKI H, FURUKAWA S, SAGISAKA A,KOTANI E, MORI H, YAMAKAWA M. Identification and functional analysis of Relish homologs in the silkworm, Bombyx mori.Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Structure and Expression,2007, 1769(9/10): 559-568.

[13] BAO Y Y, TANG X D, LV Z Y, WANG X Y, TIAN C H, XU Y P,ZHANG C X. Gene expression pro fi ling of resistant and susceptible Bombyx mori strains reveals nucleopolyhedrovirus-associated variations in host gene transcript levels. Genomics, 2009, 94: 138-145.

[14] CHENG T, LIN P, HUANG L, WU Y, JIN S, LIU C, XIA Q.Genome-wide analysis of host responses to four different types of microorganisms in Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae). Journal of Insect Science, 2016, 16(1): 69.

[15] WANG X Y, YU H Z, GENG L, XU J P, YU D, ZHANG S Z, MA Y,FEI D Q. Comparative transcriptome analysis of Bombyx mori(Lepidoptera) larval midgut response to BmNPV in susceptible and near-isogenic resistant strains. PLoS ONE, 2016, 11(5): e0155341.

[16] GANESAN S, AGGARWAL K, PAQUETTE N, SILVERMAN N.NF-κB/Rel proteins and the humoral immune responses of Drosophila melanogaster. Current Topics in Microbiology and Immunology, 2011,349: 25-60.

[17] PAN M H, XIAO S Q, CHEN M, HONG X J, LU C. Establishment and characterization of two embryonic cell lines of Bombyx mori. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal, 2007, 43(2): 101-104.

[18] HUA X T, MA X J, XUE R J, CHENG T C, WANG F, XIA Q Y.Characterization of the Bombyx mori Cecropin A1 promoter regulated by IMD pathway. Insect Science, 2016, 23(2): 297-304.

[19] PONNUVEL K M, NAKAZAWA H, FURUKAWA S, ASAOKA A,ISHIBASHI J, TANAKA H, YAMAKAWA M. A lipase isolated from the silkworm Bombyx mori shows antiviral activity against nucleopolyhedrovirus. Journal of Virology, 2003, 77(19): 10725-10729.

[20] PONNUVEL K M, NITHYA K, SIRIGINEEDI S, AWASTHI A K,YAMAKAWA M. In vitro antiviral activity of an alkaline trypsin from the digestive juice of Bombyx mori larvae against nucleopolyhedrovirus.Archives of Insect Biochemistry and Physiology, 2012, 81(2): 90-104.

[21] TERENIUS O. Hemolin—A lepidopteran anti-viral defense factor?Developmental and Comparative Immunology, 2008, 32(4): 311-316.

[22] ZHOU Y, GAO L, SHI H, XIA H, GAO L, LIAN C, CHEN L, YAO Q,CHEN K, LIU X. Microarray analysis of gene expression profile in resistant and susceptible Bombyx mori strains reveals resistancerelated genes to nucleopolyhedrovirus. Genomics, 2013, 101(4):256-262.

[23] CHENG Y, WANG X Y, DU C, GAO J, XU J P. Expression analysis of several antiviral related genes to BmNPV in different resistant strains of silkworm, Bombyx mori. Journal of Insect Science, 2014, 14:Article 76.

[24] WANG X Y, YU H Z, XU J P, ZHANG S Z, YU D, LIU M H, WANG L L. Comparative subcellular proteomics analysis of susceptible and near-isogenic resistant Bombyx mori (Lepidoptera) larval midgut response to BmNPV infection. Scientific Reports, 2017, 7: 45690.

[25] YU H, WANG X, XU J, MA Y, ZHANG S, YU D, FEI D,MUHAMMAD A. iTRAQ-based quantitative proteomics analysis of molecular mechanisms associated with Bombyx mori (Lepidoptera)larval midgut response to BmNPV in susceptible and near-isogenic strains. Journal of Proteomics, 2017, 165: 35-50.

[26] WU J, CHEN Z J. Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids. Annual Review of Immunology, 2014, 32: 461-488.

[27] KEMP C, IMLER J L. Antiviral immunity in Drosophila. Current Opinion in Immunology, 2009, 21(1): 3-9.

[28] HUANG Z, KINGSOLVER M B, AVADHANULA V, HARDY R W.An antiviral role for antimicrobial peptides during the arthropod response to alphavirus replication. Journal of Virology, 2013, 87(8):4272-4280.

[29] LUPLERTLOP N, SURASOMBATPATTANA P, PATRAMOOL S,DUMAS E, WASINPIYAMONGKOL L, SAUNE L, HAMEL R,BERNARD E, SERENO D, THOMAS F, PIQUEMAL D, YSSEL H,BRIANT L, MISSé D. Induction of a peptide with activity against a broad spectrum of pathogens in the Aedes aegypti salivary gland,following infection with Dengue virus. PLoS Pathogens, 2011, 7(1):e1001252.

[30] KANTHONG N, LAUSUTTHIPONG C, FLEGEL T W. Response to Dengue virus infections altered by cytokine-like substances from mosquito cell cultures. BMC Microbiology, 2010, 10: 290.

[31] LAUSUTTHIPONG C, KANTHONG N, FLEGEL T W. Novel,anionic, antiviral septapeptides from mosquito cells also protect monkey cells against dengue virus. Antiviral Research, 2013, 98: 449-456.

[32] ELEFTHERIANOS I, XU M, YADI H, FFRENCH-CONSTANT R H,REYNOLDS S E. Plasmatocyte-spreading peptide (PSP) plays a central role in insect cellular immune defenses against bacterial infection. The Journal of Experimental Biology, 2009, 212: 1840-1848.

[33] ISHII K, ADACHI T, HAMAMOTO H, OONISHI T, KAMIMURA M, IMAMURA K, SEKIMIZU K. Insect cytokine paralytic peptide activates innate immunity via nitric oxide production in the silkworm Bombyx mori. Developmental and Comparative Immunology, 2013,39: 147-153.

[34] MATSUMOTO H, TSUZUKI S, DATE-ITO A, OHNISHI A,HAYAKAWA Y. Characteristics common to a cytokine family spanning five orders of insects. Insect Biochemistry and Molecular Biology,2012, 42: 446-454.

[35] MAJOROS A, PLATANITIS E, KERNBAUER-H?LZL E,ROSEBROCK F, MüLLER M, DECKER T. Canonical and noncanonical aspects of JAK-STAT signaling: lessons from interferons for cytokine responses. Frontiers in Immunology, 2017, 8: Article 29.

[36] LIU W, LIU J, LU Y, GONG Y, ZHU M, CHEN F, LIANG Z, ZHU L,KUANG S, HU X, CAO G, XUE R, GONG C. Immune signaling pathways activated in response to different pathogenic micro- organisms in Bombyx mori. Molecular Immunology, 2015, 65: 391-397.

[37] MYLLYM?KI H, R?MET M. JAK/STAT pathway in Drosophila immunity. Scandinavian Journal of Immunology, 2014, 79(6): 377-385.

[38] RAPOSO R A, TRUDGIAN D C, THOMAS B, VAN WILGENBURG B, COWLEY S A, JAMES W. Protein kinase C and NF-κB-dependent CD4 down-regulation in macrophages induced by T cell-derived soluble factors: consequences for HIV-1 infection. Journal of Immunology, 2011, 187(2): 748-759.

[39] BARRECA M M, SPINELLO W, CAVALIERI V, TURTURICI G,SCONZO G, KAUR P, TINNIRELLO R, ASEA A, GERACI F.Extracellular Hsp70 enhances mesoangioblast migration via an autocrine signaling pathway. Journal of Cellular Physiology, 2017,232(7): 1845-1861.

[40] KIM M Y, SHU Y, CARSILLO T, ZHANG J, YU L, PETERSON C,LONGHI S, GIROD S, MIEWIESK S, OGLESBEE M. hsp70 and a novel axis of type I interferon-dependent antiviral immunity in the measles virus-infected brain. Journal of Virology, 2013, 87(2):998-1009.

[41] HU X, ZHU M, WANG S, ZHU L, XUE R, CAO G, GONG C.Proteomics analysis of digestive juice from silkworm during Bombyx mori nucleopolyhedrovirus infection. Proteomics, 2015, 15(15):2691-2700.