魏迎輝，劉志國，徐奎，Evanna Huyhn ，Paul Dyce ，李繼良，周偉良，董樹仁，馮保亮，牟玉蓮，Julang Li 2,，李奎

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，中國北京 100193；2佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，中國廣東佛山528000；3Department of Animal BioSciences, University of Guelph, Canada Ontario N1G 2W1；4天津市寧河原種豬場，中國天津 301504）

0 引言

【研究意義】豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus , PRRSV）引起的以妊娠母豬早產(chǎn)、晚期流產(chǎn)、死胎、弱胎和木乃伊胎等繁殖障礙及仔豬和生長豬的呼吸系統(tǒng)疾病為主要特征的一種高致死性的傳染病[1-2]。因該病在臨床上表現(xiàn)為耳部皮膚紫紺，所以又被稱為“藍(lán)耳病”。根據(jù)抗原性，基因組及致病性的差異，PRRSV可分為2個(gè)型，即歐洲型和美洲型，又被稱為1型和2型[3-5]。PRRS于1987年首次在美國被發(fā)現(xiàn)，緊接著于1989 年在歐洲爆發(fā)，并逐漸向世界其他地區(qū)擴(kuò)散，其在世界范圍內(nèi)的頻繁爆發(fā)對養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失[6-7]。自20世紀(jì)90年代初期，科學(xué)家們通過表型選擇、免疫遺傳標(biāo)記輔助選擇等途徑開展了很多PRRSV的抗病育種工作，也取得了很大的進(jìn)展，但并未從根本上杜絕疾病的發(fā)生。PRRSV在與機(jī)體互作時(shí)，能夠抑制天然免疫、延遲中和抗體的產(chǎn)生，再加上抗病性狀屬于多基因性狀，PRRSV基因組易發(fā)生變異，導(dǎo)致國內(nèi)外市面上的疫苗效果并不理想。隨著分子育種手段的不斷發(fā)展和PRRSV致病機(jī)理的逐漸清楚，利用遺傳操作手段制備對 PRRSV引起的傳染性疾病具有抗性的動物育種新材料對畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】PRRSV在體內(nèi)主要通過侵染豬肺泡巨噬細(xì)胞（porcine alveolar macrophages，PAM）表面的受體而發(fā)揮作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，硫酸乙酰肝素（heparin sulphate, HS）、唾液酸粘附素（sialoadhesin, Sn）和CD163（cluster of differentiation 163）分子是PAM上存在的能與PRRSV結(jié)合的3個(gè)重要受體分子[9]。其中，CD163是一種富含半胱氨酸的清道夫受體，屬于典型的Ⅰ型糖基化蛋白，也是一種巨噬細(xì)胞分化的抗原，因其分子大小為130kDa，故又被稱為M130蛋白[10]。有研究表明，在PRRSV非易感細(xì)胞系（BHK-21和PK-15）中轉(zhuǎn)染表達(dá)CD163分子可以使這些細(xì)胞系感染PRRSV并在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生子代病毒粒子，而抗人CD163的抗體可以阻斷 PRRSV 的感染，表明 CD163 是該病毒的必需受體[11]。VAN GORP等研究發(fā)現(xiàn) CD163蛋白結(jié)構(gòu)域scavenger receptor cysteine-rich domain 5（SRCR5）由第7外顯子所編碼，是病毒感染細(xì)胞所必需的，而氨基端的4個(gè)scavenger receptor cysteine-rich（SRCR）區(qū)域和胞質(zhì)尾部是非必需的[12]。近幾年，科學(xué)家們成功通過敲除或者替換宿主內(nèi)源的受體基因來達(dá)到抗PRRSV的目的。WHITWORTH等利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除豬內(nèi)源CD163基因，活體攻毒試驗(yàn)證明敲除豬具有抵抗1型和2型PRRSV的能力[5,13-14]。隨后，WELLS等獲得用人的同源基因CD163-like的SRCR8區(qū)域替換豬CD163的SRCR5區(qū)域的基因修飾豬，攻毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該基因替換豬具有抵抗1型PRRSV和降低感染2型PRRSV的能力[5]。最近，BURKARD等獲得了刪除豬CD163的SRCR5結(jié)構(gòu)域的基因編輯豬，細(xì)胞水平試驗(yàn)證明，其巨噬細(xì)胞具有抵抗1型和2型PRRSV的表型，同時(shí)該編輯豬在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件下生長發(fā)育正常[15]。另外，LI等發(fā)現(xiàn) siRNA能夠引起特異性的抗病毒反應(yīng)后，其通過攻毒實(shí)驗(yàn)證明重組腺病毒介導(dǎo)的RNAi可以使豬抵抗PRRSV 的感染[16]。LU等制備的過表達(dá)histone deacetylase6（HDAC6）轉(zhuǎn)基因豬能夠阻礙病毒復(fù)制，延緩發(fā)病時(shí)間，減弱發(fā)病癥狀，并表現(xiàn)出對PRRSV的抗性[17]。【本研究切入點(diǎn)】目前，盡管關(guān)于CD163基因編輯豬已有研究報(bào)道，然而利用體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得無篩選標(biāo)記的 CD163雙等位基因編輯純合豬的研究國內(nèi)未見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)結(jié)合體細(xì)胞核移植制備CD163雙等位基因編輯豬，既無外源篩選標(biāo)記引入同時(shí)又可以快速擴(kuò)繁后代，可獲得具有抵抗PRRSV能力的育種新材料。

1 材料與方法

本研究于2015年9月到2017年12月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所豬基因工程與種質(zhì)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室和天津市寧河原種豬場完成。

1.1 材料

試驗(yàn)用到的細(xì)胞為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所豬基因工程與種質(zhì)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì) 2013年分離的純種大白豬胎兒成纖維細(xì)胞，CRISPR/Cas9載體為pX330-U6-hSpCas9載體。

1.2 方法

1.2.1 豬CD163基因gRNA設(shè)計(jì)和載體構(gòu)建 首先鎖定編碼豬CD163基因SRCR5結(jié)構(gòu)域的第7外顯子的打靶區(qū)域，利用麻省理工學(xué)院張峰實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的網(wǎng)站（http://crispr.mit.edu）對其打靶區(qū)域進(jìn)行評分，從候選的打靶位點(diǎn)中選擇一個(gè)合適的 gRNA，其序列為GGAAACCCAGGCTGGTTGGA。根據(jù)gRNA序列合成互補(bǔ)配對的寡聚核苷酸，合成的寡聚核苷酸序列如下：CD163-gRNA-F：caccGGAAACCCAGGCTGGTT GGA，CD163-gRNA-R：aaacTCCAACCAGCCTGGGT TTCC。載體構(gòu)建步驟為：（1）將兩條寡聚核苷酸稀釋至 10μmol·L-1后各取 10μL， 98℃反應(yīng) 10min，在自然冷卻至室溫的條件下對其進(jìn)行退火。（2）37℃條件下，用限制性內(nèi)切酶 Bbs I 對含有 Cas9序列的pX330骨架載體酶切2h，切膠回收線性化片段。（3）回收的線性化載體骨架與退火的寡聚核苷酸 16℃連接 1h，隨后轉(zhuǎn)化 Top10或 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐的LB平板進(jìn)行生長，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并測序，測序引物為U6-FWD。序列正確后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用去內(nèi)毒素大提質(zhì)粒試劑盒提取pX330-CD163-gRNA質(zhì)粒，所提的質(zhì)粒純化后用于細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。

1.2.2 轉(zhuǎn)染效率檢測和gRNA活性檢測 轉(zhuǎn)染前一天將原代大白豬胎兒成纖維細(xì)胞復(fù)蘇至6cm平皿中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%—80%匯合度時(shí)即可進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分兩組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，一組轉(zhuǎn)染表達(dá)EGFP的質(zhì)粒，另一組轉(zhuǎn)染pX330-CD163-gRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照 Basic Primary Fibroblasts Nucleofector Kit（Lonza）試劑盒說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染后 48h，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)EGFP組的細(xì)胞發(fā)光情況用以檢測細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)pX330-CD163-gRNA質(zhì)粒48h后的細(xì)胞部分用于鋪板，另一部分用以提取基因組檢測gRNA活性。以提取的細(xì)胞基因組為模板，用Pre mixTaq DNA聚合酶進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出300bp片段，引物為CD163-F：5′- AAGCCCACTGTAGGCAGAA-3′和 CD163-R：5′-GTGGTTTCCCTCCTGGGG-3′。擴(kuò)增條件為 95℃，5min；95℃，30s；61℃，30s，36個(gè)循環(huán)；72℃，30s；72℃，10min；PCR產(chǎn)物送北京天一輝遠(yuǎn)公司測序，根據(jù)靶位點(diǎn)附近序列的套峰情況即可對gRNA的活性進(jìn)行檢測。

1.2.3 單克隆細(xì)胞培養(yǎng) 將電轉(zhuǎn) 48h后細(xì)胞鋪板于10cm培養(yǎng)皿中，每3d更換一次培養(yǎng)液。鋪板后10d左右可以觀察到合適大小的克隆點(diǎn)，將單克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)取部分細(xì)胞提取基因組用以基因型鑒定。

1.2.4 單克隆細(xì)胞基因型鑒定 以提取的細(xì)胞基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR按照1.2.2的條件進(jìn)行操作。PCR產(chǎn)物送北京天一輝遠(yuǎn)公司測序，根據(jù)測序結(jié)果，篩選具有移碼突變的純合編輯細(xì)胞用作核移植的供體細(xì)胞。

1.2.5 體細(xì)胞核移植及克隆豬基因型鑒定 以體外成熟40h的青年豬卵母細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞，將核移植供體細(xì)胞移入去核的卵母細(xì)胞，經(jīng)電融合與激活，構(gòu)建成重組克隆胚胎，挑選發(fā)育狀態(tài)良好的克隆重組胚胎用手術(shù)法移入自然發(fā)情的經(jīng)產(chǎn)大白母豬子宮內(nèi)進(jìn)行妊娠。胚胎移植后，技術(shù)人員注意觀察其返情情況，定期用B型超聲波檢查受體母豬妊娠情況。小豬出生后剪取部分耳樣，提取基因組后進(jìn)行PCR和測序鑒定。

1.2.6 克隆豬的擴(kuò)繁及 F1代仔豬基因型鑒定CD163雙等位基因編輯公豬與野生型大白母豬交配，擴(kuò)繁后代并定期檢查交配母豬的妊娠情況。F1代仔豬出生后剪取部分耳樣，提取基因組后進(jìn)行PCR和T-A克隆測序，鑒定其基因型。

2 結(jié)果

2.1 豬CD163基因gRNA設(shè)計(jì)及活性檢測

針對大白豬的第7外顯子序列設(shè)計(jì)了一條gRNA（圖 1-A），構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)胞，靶位點(diǎn)PCR測序檢測gRNA活性。與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組對比，轉(zhuǎn)染 pX330-CD163-gRNA質(zhì)粒組靶位點(diǎn)下游出現(xiàn)套峰（圖 1-B），可說明部分細(xì)胞靶位點(diǎn)附近序列處造成了堿基的隨機(jī)插入或缺失，說明 pX330-CD163-gRNA能夠?qū)Π形稽c(diǎn)進(jìn)行切割。

圖1 gRNA靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)和打靶效率檢測Fig. 1 Design of gRNA and detection of the target efficiency

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率檢測

將表達(dá) EGFP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞，48h后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞發(fā)光情況，結(jié)果顯示大部分細(xì)胞能夠表達(dá) EGFP蛋白（圖 2），表明轉(zhuǎn)染效率較高。

2.3 單克隆細(xì)胞培養(yǎng)及基因型鑒定

通過PCR和測序鑒定獲得的127個(gè)單克隆細(xì)胞基因型，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示共有21個(gè)細(xì)胞克隆的CD163基因發(fā)生移碼突變，突變效率為16.5%，其中有14個(gè)克?。?1.0%）出現(xiàn)單等位基因突變或雙等位基因雜合突變，7個(gè)克?。?.5%）為雙等位基因純合突變（圖3-A）。7個(gè)雙等位基因純合突變克隆的基因型如圖3-B所示。

圖2 轉(zhuǎn)染效率檢測Fig. 2 Detection of cell transfection efficiency

2.4 克隆豬的基因型檢測及蛋白序列預(yù)測

選擇 CD163-34號細(xì)胞克?。?50bp/-50bp）作為核供體進(jìn)行體細(xì)胞核移植，移植受體母豬3頭，成功獲得CD163雙等位基因純合編輯的大白豬。采取豬耳組織進(jìn)行基因型鑒定，PCR和測序結(jié)果顯示該豬CD163基因型與供體細(xì)胞克隆基因型一致，均為雙鏈缺失50bp（圖4-A、B）。CD163基因編輯豬缺失50bp后，第7外顯子缺失16個(gè)氨基酸，同時(shí)發(fā)生移碼突變并提前終止（圖4-C）。

圖3 克隆基因型鑒定Fig. 3 Detection ofclone genotyping

圖4 克隆豬基因型鑒定及蛋白序列預(yù)測Fig. 4 Detection of cloned pigs genotyping and prediction of protein sequence

2.5 基因編輯豬的種系傳代

CD163雙等位基因編輯公豬與野生型大白母豬繁殖獲得15頭F1代仔豬，其中5頭公豬，10頭母豬，仔豬平均出生重為 1.21kg（圖 5-A）。提取 F1代仔豬耳緣組織 DNA，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行T-A克隆并測序鑒定其基因型，結(jié)果表明為 CD163基因雜合（WT/-50bp）型（圖5-B、C）。

圖5 F1代仔豬基因型鑒定Fig. 5 Detection of F1 piglets genotyping

3 討論

CRISPR/Cas9 技術(shù)介導(dǎo)的基因突變是指 Cas9蛋白通過sgRNA靶向識別并定點(diǎn)切割基因組DNA，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂（double strand break, DSB），細(xì)胞通過非同源末端連接修復(fù)機(jī)制修復(fù) DSB時(shí)所引發(fā)的切割位點(diǎn)處 DNA堿基的插入或缺失[18]。II型CRISPR/Cas系統(tǒng)已經(jīng)在各物種中得到了較為廣泛的應(yīng)用，如：小鼠[19-21]、大鼠[22]、豬[23-25]、牛[26-27]、羊[28]、猴子[29]、斑馬魚[30]、果蠅[31]、線蟲[32]等。與基因打靶、ZFN、TALEN等基因修飾技術(shù)相比，CRISPR/Cas9具有操作簡單、效率高等諸多優(yōu)勢，利用CRISPR/Cas9對重要經(jīng)濟(jì)性狀基因進(jìn)行修飾已經(jīng)成為家畜新品種培育的重要手段[33]。

最近幾年，科學(xué)家們通過CRISPR/Cas9技術(shù)已成功獲得抗 PRRSV的基因編輯豬[5,13-15]。密蘇里大學(xué)Prather團(tuán)隊(duì)通過細(xì)胞水平和個(gè)體水平攻毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)制備的 CD163基因敲除豬具有同時(shí)抵抗 1型和 2型PRRSV的能力，而用人的同源基因 CD163-like的SRCR8區(qū)域替換豬CD163的SRCR5區(qū)域制備的基因替換豬具有抵抗1型PRRSV的能力，其對2型PRRSV易感性降低，但與對照相比差異不明顯[5,13]。愛丁堡大學(xué)ARCHIBALD團(tuán)隊(duì)通過刪除CD163基因SRCR5區(qū)域獲得的基因敲除豬，細(xì)胞水平攻毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其PAM細(xì)胞不受1型和2型PRRSV的感染，這一研究成果同 PRATHER團(tuán)隊(duì)的結(jié)論一致[15]。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對PRRSV受體基因CD163進(jìn)行修飾，用構(gòu)建好的pX330-CD163-gRNA載體轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞并檢測gRNA活性，結(jié)果表明在無任何篩選標(biāo)記富集的情況下，pX330-CD163-gRNA能夠有效的對靶位點(diǎn)進(jìn)行識別和切割?？紤]到CRISPR/Cas9的高效編輯特性和篩選標(biāo)記殘留引起的安全問題，本研究中細(xì)胞單克隆的篩選沒有使用藥物、流式等細(xì)胞富集方法，但是仍然得到了 21個(gè)移碼突變的細(xì)胞單克隆，整體突變效率達(dá) 16.5%（21/127），其中 7個(gè)細(xì)胞克隆為雙等位基因純合突變，效率達(dá)到5.5%。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)成功制備了 CD163雙等位基因編輯的純合大白豬，并通過擴(kuò)繁獲得了后代。綜合分析首批F1代基因編輯仔豬的出生數(shù)據(jù)，未發(fā)現(xiàn)CD163基因編輯對豬繁殖性能有不利的影響。該研究獲得的基因編輯豬不攜帶篩選標(biāo)記，能夠安全地為培育抗 PRRSV的新品種豬提供育種材料，同時(shí)可為進(jìn)一步闡明藍(lán)耳病發(fā)病機(jī)制的研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)，成功制備出CD163雙等位基因純合編輯大白豬，并已獲得CD163F1代基因編輯豬，安全并快速地為培育抗PRRSV新品種豬提供了育種新材料。

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