王堅(jiān) 胡明冬 唐曉丹 葛海燕 彭正羽 宋元林 夏世金

低氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension, HPH)是極高致死率和極高致殘率的病理生理綜合征，被冠以“假惡性”腫瘤之稱[1]，嚴(yán)重危害人們的健康，尚沒(méi)有根治的方法。低氧性肺血管結(jié)構(gòu)重建(hypoxic pulmonary vascular structural remodeling, HPVSR)是HPH形成的基本病理生理特征之一[2-3]。平滑肌細(xì)胞是組成肺血管壁最重要的細(xì)胞，低氧所致的肺平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能異常是HPH形成的一種主要病理生理機(jī)制。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscular cells, PASMC)是組成肺動(dòng)脈結(jié)構(gòu)的主要細(xì)胞之一，在HPH形成中的作用至關(guān)重要。低氧能導(dǎo)致PASMC異常增殖，促進(jìn)HPVSR，加速HPH發(fā)生與發(fā)展[2，4-6]?；赑ASMC結(jié)構(gòu)異常在HPH發(fā)生和發(fā)展中的關(guān)鍵作用，抑制PASMC異常增殖已成為HPH靶向治療的研究熱點(diǎn)。

近年來(lái)備受關(guān)注的環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)有可能為闡明HPH的機(jī)制提供新方法。circRNA通過(guò)與疾病關(guān)聯(lián)的miRNA相互作用在疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，為闡明疾病發(fā)生機(jī)制、干預(yù)靶點(diǎn)和新型診斷標(biāo)志物提供了新手段和新策略[7-9]。

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)HPH模型小鼠肺組織進(jìn)行circRNA芯片篩選和qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明HPH模型組(與常氧組比較)小鼠肺組織中環(huán)狀RNA mmu-circ-0001033表達(dá)顯著下調(diào)[10]，由此推測(cè)環(huán)狀RNA mmu-circ-0001033可能參與HPH發(fā)生機(jī)制。為了闡明 mmu-circ-0001033在HPH形成中的作用，我們進(jìn)行環(huán)狀RNA mmu-circ-0001033過(guò)表達(dá)對(duì)低氧性PASMC增殖的影響實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)慢病毒介導(dǎo)mmu-circ-0001033轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的小鼠PASMC，觀察增強(qiáng)mmu-circ-0001033表達(dá)對(duì)低氧性PASMC增殖的影響，為進(jìn)一步研究mmu-circ-0001033在調(diào)節(jié)HPH中的作用與機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、材料及主要試劑

10只健康雄性C57BL/6小鼠(購(gòu)自上海杰思捷動(dòng)物有限公司)。CCK-8(Cell Counting Kit)試劑盒(上海碧云天)、DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco，USA)、0.25%胰蛋白酶(Gibco，USA)、胎牛血清(Gibco，USA)、細(xì)胞培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶(Corning，USA)、二甲基亞砜(DMSO，Sigma，USA)；Nanovue的分光光度計(jì)(美國(guó)GE公司)；自動(dòng)常壓缺氧孵箱(德國(guó)賀氏公司)。其余試劑是國(guó)產(chǎn)分析純。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 原代PASMC的培養(yǎng)與分組: 采用貼塊法培養(yǎng)細(xì)胞。取健康雄性C57BL/6小鼠，10%烏拉坦腹腔注射麻醉后，在無(wú)菌條件下打開(kāi)小鼠胸腔取出肺動(dòng)脈干和左右肺動(dòng)脈，縱向剪開(kāi)血管壁，用眼科彎鑷鈍性刮除殘余的血管內(nèi)膜，用含有抗菌素的PBS反復(fù)沖洗，將中膜剪成1 mm×1 mm大小，用彎頭滴管移入到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，組織塊之間距為0.5 cm左右。將植塊面翻轉(zhuǎn)，置于培養(yǎng)箱中。2 h后輕輕翻轉(zhuǎn)并加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，組織塊浸泡在培養(yǎng)液，靜置1周。1周后觀察及換液。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿瓶底80%左右時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。細(xì)胞在光鏡下呈典型的峰-谷狀表現(xiàn)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體染色陽(yáng)性，鑒定細(xì)胞。取3～5代細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。低氧處理：置入自動(dòng)常壓缺氧孵箱(德國(guó)賀氏公司)進(jìn)行低氧處理。氧濃度：常氧21% O2，低氧2.5% O2。實(shí)驗(yàn)分4組：常氧組、低氧組、mmu-circ-0001033過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染+低氧組、空白載體慢病毒轉(zhuǎn)染+低氧組。

2. mmu-circ-0001033過(guò)表達(dá)慢病毒構(gòu)建

(1)慢病毒包裝：制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，使用質(zhì)粒載體進(jìn)行高純度無(wú)內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h和72 h后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，4 ℃，2 000×g，離心10 min，去除細(xì)胞碎片，然后收集病毒上清液，再行超離。4 ℃，82 700×g，離心120 min，對(duì)其超離，最后得到高滴度的慢病毒超離液。

(2)滴度檢測(cè)：①細(xì)胞準(zhǔn)備：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至1×105/ml，加入96孔板，100 μl/孔，為每個(gè)病毒準(zhǔn)備6個(gè)孔。放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng); ②加病毒：第2天，準(zhǔn)備6個(gè)1.5 ml EP管，第一個(gè)EP管中加入10 μl病毒液，然后做3倍梯度稀釋，共6個(gè)稀釋度; ③追加培養(yǎng)液：第3天，有需要加嘌呤霉素篩選的孔，先吸去100 ml含病毒培養(yǎng)基，加入100 μl含1.5 μg/ml 嘌呤霉素的10% FBS完全培養(yǎng)基; ④觀察結(jié)果并計(jì)算滴度：第5天，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，在觀察結(jié)果前6 h需更換新鮮10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，從孔中吸出80 μl培養(yǎng)基，然后加入80 μl新鮮10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，熒光百分比在10～30%的孔計(jì)算病毒滴度。滴度(TU/ml)=細(xì)胞數(shù)×熒光百分比×MOI×病毒稀釋倍數(shù)×103。

3. 慢病毒載體轉(zhuǎn)染: 取PASMC鋪于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。mmu-circ-0001033過(guò)表達(dá)慢病毒經(jīng)擴(kuò)增、鑒定、純化后用于本實(shí)驗(yàn)。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，然后吸出培養(yǎng)液，加入mmu-circ-0001033過(guò)表達(dá)慢病毒或空白載體慢病毒轉(zhuǎn)染液，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞孵箱培養(yǎng)1 h后棄轉(zhuǎn)染液。未轉(zhuǎn)染組不加慢病毒轉(zhuǎn)染液，其余同轉(zhuǎn)染組。后續(xù)在常氧(21% O2)和低氧(2.5% O2)條件下進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

4. qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞mmu-circ-0001033的表達(dá)水平： 采用Trizol法分別提取各組細(xì)胞的總RNA。用Nanovue的分光光度計(jì)測(cè)定各組RNA濃度。運(yùn)用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA以用于后續(xù)的qRT-PCR檢測(cè)。應(yīng)用Bio-Rad公司的PCR儀進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。引物序列如下：GAPDH-F: 5′-GTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′；GAPDH-R：5′-GCCCCTCCTGTTATTATGG-3′；mmu-circ-0001033-F： 5′-CTGTCCCAACTGTAAAGAAGGTG-3′；mmu-circ-0001033-R：5′-CATCGGTTTGGTGCTCCTC-3′。

5. CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖: 主要操作步驟：①在96孔板中配置100 μl的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h(37 ℃，5% CO2)；②向培養(yǎng)板加入10 μl不同濃度的待測(cè)物質(zhì)；③將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育所設(shè)定的時(shí)間；④向每孔加入10 μl CCK-8溶液；⑤將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h；⑥用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、 低氧下調(diào)PASMC中mmu-circ-0001033的表達(dá)

低氧誘導(dǎo)PASMC中mmu-circ-0001033的表達(dá)明顯下調(diào)，且呈時(shí)間依賴性。見(jiàn)圖1。

圖1 低氧誘導(dǎo)PASMC中mmu-circ-0001033的表達(dá)下調(diào)；與Control組比較，*P<0.05，**P<0.01，n=3

二、 mmu-circ-0001033過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果

與對(duì)照組比較，慢病毒轉(zhuǎn)染組中mmu-circ-0001033表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，提示mmu-circ-0001033過(guò)表達(dá)慢病毒成功轉(zhuǎn)染入PASMC，且并高效表達(dá)，見(jiàn)圖2。

圖2 mmu-circ-0001033過(guò)表達(dá)慢病毒成功轉(zhuǎn)染PASMC；與Control組比較，*P<0.05，n=3

三、 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果

與常氧組比較，低氧組和空白載體慢病毒轉(zhuǎn)染+低氧組PASMC增殖明顯增多(P<0.05)，而mmu-circ-0001033過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染+低氧組PASMC增殖顯著下降。說(shuō)明過(guò)表達(dá)的mmu-circ-0001033 顯著抑制低氧所誘導(dǎo)的PASMC的增殖，見(jiàn)圖3。

圖3 細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果；注：1～4：常氧組、低氧組、空白載體慢病毒轉(zhuǎn)染+低氧組、mmu-circ-0001033過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染+低氧組；與Control組比較，**P<0.01，n=3

討 論

本實(shí)驗(yàn)研究首次發(fā)現(xiàn)，低氧可導(dǎo)致PASMC異常增殖和mmu-circ-0001033的表達(dá)明顯下調(diào)，而慢病毒介導(dǎo)的mmu-circ-0001033過(guò)表達(dá)能顯著抑制低氧所誘導(dǎo)的PASMC的增殖，提示增強(qiáng)mmu-circ-0001033表達(dá)可抑制PASMC的增殖，這為mmu-circ-0001033過(guò)表達(dá)改善HPVSR，從為而防治HPH提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

circRNA作為RNA家族成員，具有特征性的共價(jià)閉合環(huán)結(jié)構(gòu)的特征性。circRNA具有種屬、組織、疾病及發(fā)育階段等的特異性，與多種疾病，尤其是惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。circRNA的主要功能是通過(guò)海綿吸附miRNA發(fā)揮生物學(xué)功能，同時(shí)還具有調(diào)控轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后過(guò)程、可變剪接、編碼蛋白以及充當(dāng)?shù)鞍渍T餌等作用。目前多種預(yù)測(cè)方法被提出用于發(fā)現(xiàn)circRNA[8]。

目前認(rèn)為，circRNA是存在于生物中具有共價(jià)閉合環(huán)結(jié)構(gòu)特征的非編碼RNA[11]。circRNA曾經(jīng)被認(rèn)為是RNA剪切所形成的錯(cuò)誤產(chǎn)物而輕視為“垃圾”[12-13]。然而，科學(xué)家們應(yīng)用高通量測(cè)序確認(rèn)circRNA是細(xì)胞基因表達(dá)的一種形式[14]。研究還發(fā)現(xiàn)circRNA具有保守性、穩(wěn)定性、多樣性和豐富性，參與調(diào)節(jié)胞內(nèi)其他RNA的功能，在惡性腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)精神性疾病、先兆子癇以及2型糖尿病等發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[8]。

circRNA在心血管疾病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。Burd等[15]發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病中來(lái)自INK4A/ARF位點(diǎn)的環(huán)狀RNA(cANRIL)的表達(dá)量與INK4A/ARF的轉(zhuǎn)錄以及動(dòng)脈粥樣硬化性血管病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，其機(jī)制可能是cANRIL募集PcG復(fù)合物導(dǎo)致INK4A/ARF的沉默，增加了動(dòng)脈粥樣硬化性血管病發(fā)生的易感性。Wang等[16]發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA(HRCR)能夠海綿吸附miR-223，抑制miR-223的活性，促進(jìn)ARC蛋白表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而抑制心肌肥厚和心衰的發(fā)生。Foxo3 circular RNA能夠抑制抗衰老和抗應(yīng)激相關(guān)蛋白，促進(jìn)阿霉素誘導(dǎo)的心肌病的發(fā)生[17]。 Geng等[18]發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA(Cdr1as)能夠海綿吸附miR-7a上調(diào)PARP和SP1蛋白的表達(dá)，進(jìn)而增加心梗的面積，提示Cdr1as有望作為心梗的治療靶點(diǎn)。本研究提示，環(huán)狀RNA mmu-circ-0001033在肺動(dòng)脈高壓發(fā)生中可能具有重要作用。

慢病毒載體是指以人類免疫缺陷病毒-1 (human immunodeficiency virus-1，HIV-1) 來(lái)源的一種病毒載體，慢病毒載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息，是慢病毒載體系統(tǒng)的主要組成部分。慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，攜帶有外源基因的慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過(guò)病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒，通過(guò)感染細(xì)胞或活體組織，實(shí)現(xiàn)外源基因在細(xì)胞或活體組織中表達(dá)。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中慢病毒己經(jīng)成為表達(dá)外源基因的常用載體之一， 且正在獲得越來(lái)越廣泛的應(yīng)用?；诼《据d體的優(yōu)勢(shì)，本研究構(gòu)建了mmu-circ-0001033過(guò)表達(dá)慢病毒載體，實(shí)現(xiàn)了mmu-circ-0001033在PASMC中進(jìn)行穩(wěn)定且高效的表達(dá)，為研究mmu-circ-0001033的生物學(xué)功能提供強(qiáng)有力的手段。

然而，本研究?jī)H僅觀察到低氧下調(diào)PASMC mmu-circ-0001033表達(dá)，以及慢病毒介導(dǎo)的mmu-circ-0001033過(guò)表達(dá)能顯著抑制低氧所誘導(dǎo)的PASMC的增殖，但對(duì)其機(jī)制尚不清楚；此外，本研究的結(jié)論也需要進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，更需要用HPH臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證。

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