張?chǎng)?熊葉 馬可 李強(qiáng),3

近年來通過新一代測(cè)序技術(shù)分析，人們發(fā)現(xiàn)機(jī)體擁有非常多樣化的微生物群落，而這些微生物群落被認(rèn)為對(duì)人體健康至關(guān)重要。已有證據(jù)顯示人體不同部位微生物菌群的改變與癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[1-4]。但到目前為止關(guān)于肺部菌群與肺癌之間關(guān)系的研究相對(duì)較少，是否會(huì)像其它部位的菌群一樣，變化的肺部菌群影響著肺癌的發(fā)生發(fā)展目前仍不明確。本研究旨在觀察對(duì)比腺癌患者下呼吸道和健康肺下呼吸道菌群結(jié)構(gòu)是否存在差異。

對(duì)象與方法

一、一般資料

收集12例在上海長(zhǎng)海醫(yī)院胸外科行肺葉切除術(shù)的肺腺癌患者作為疾病組(DT組)。12例患者術(shù)前經(jīng)血清學(xué)及影像學(xué)檢查除外合并肺炎，其中男性6例，女性6例，年齡51～73歲(平均64.3歲)。12例患者術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)均診斷為肺腺癌，臨床分期Ⅰb期1例，Ⅱa期6例，Ⅱb期3例，Ⅲa期2例。同時(shí)收集5例在無(wú)錫市人民醫(yī)院手術(shù)室行雙肺移植手術(shù)過程中修剪下來的健康肺氣管組織作為健康對(duì)照組(H組)，5例患者均為男性，年齡34～50歲(平均40.5歲)，影像學(xué)檢查無(wú)明顯感染病灶。所有樣本在收集前由本人或家屬簽署知情同意書。

二、呼吸道組織收集及處理

手術(shù)室內(nèi)獲取組織后，放入2 ml的無(wú)菌Eppendorf管，并做好標(biāo)記，立即放入液氮中瓶中，之后轉(zhuǎn)運(yùn)至我科實(shí)驗(yàn)室-80°下凍存。干冰下運(yùn)送至派森諾醫(yī)藥科技有限公司，無(wú)菌技術(shù)下對(duì)組織進(jìn)行研磨、均漿、DNA提取。

三、測(cè)序與分析

本研究采用前引物(5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′)和后引物(5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′)，對(duì)樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測(cè)序文庫(kù)，利用Iliumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)對(duì)細(xì)菌的16S rDNA基因V4區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序。對(duì)原始下機(jī)數(shù)據(jù)根據(jù)序列質(zhì)量進(jìn)行初步篩查，并去除嵌合體等疑問序列。應(yīng)用UCLUST序列比對(duì)工具[5]，對(duì)獲得的高質(zhì)量序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU劃分。通過QIIME軟件將OTU代表序列與Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)[6]的模板序列相比對(duì)，獲取每個(gè)OTU所對(duì)應(yīng)的分類學(xué)信息。之后對(duì)每個(gè)樣本α多樣性指標(biāo)(Chao1、ACE、Simpson及Shannon指數(shù))進(jìn)行計(jì)算，同時(shí)計(jì)算各樣本在門及屬水平上的OTU數(shù)。使用Mothur軟件，調(diào)用Metastats對(duì)門和屬水平的各個(gè)分類單元在樣本(組)之間的序列量(即絕對(duì)豐度)差異進(jìn)行兩兩比較檢驗(yàn)。通過Galaxy在線分析平臺(tái)提交屬水平的相對(duì)豐度矩陣進(jìn)行LEfSe分析。使用PICRUSt軟件，根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中微生物代謝功能的類別對(duì)群落樣本進(jìn)行預(yù)測(cè)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)符合正態(tài)分布的兩組數(shù)據(jù)應(yīng)用t檢驗(yàn)；對(duì)不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，則進(jìn)行非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。

結(jié) 果

一、樣本菌群群落概況

17例組織樣本中產(chǎn)生了總共623,370個(gè)高質(zhì)量序列，平均每個(gè)樣本有36,668個(gè)序列。對(duì)前述獲得的高質(zhì)量序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU劃分，通過去除一些豐度和出現(xiàn)頻率都非常低的“稀有”O(jiān)UT(當(dāng)于菌群數(shù)據(jù)中的“背景噪音”)后，共計(jì)產(chǎn)生38,220個(gè)OUT，平均每個(gè)樣本具有2,248個(gè)OUT。23個(gè)高豐度(大于1%)的OTUs占所有序列的80%，大多數(shù)剩余的OTUs以低豐度存在(<1%)。根據(jù)樣本OUT劃分和各分類水平微生物類群數(shù)統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，兩組患者下呼吸道組織標(biāo)本中4個(gè)最豐富的菌門包括：Proteobacteria(65%)，F(xiàn)irmicutes(18%)，Bacteroidetes(9%)和Acidobacteria(2%)，共占了總序列的94%；最豐富的屬主要包括：Burkholderia(20%)、Sediminibacterium(7.4%)、Lactobacillus(6%)、Acinetobacter(3.8%)、Pseudomonas(3.7%)、Lactococcus(3.3%)、Caulobacter(3%)、Ralstonia(2.7%)共占了總序列的50%，見圖1。

圖1 DT組與H組在菌門(左圖)及菌屬水平(右圖)相對(duì)豐度情況

二、兩組菌群多樣性及主要菌群豐度比較結(jié)果

兩組α多樣性指數(shù)：Chao1，ACE，Shannon和Simpson如表1所示。從反映菌群豐度的Chao1和ACE指數(shù)來看，H組明顯高于DT組(P<0.01)。Shannon和Simpson指數(shù)反應(yīng)了菌群的多樣性，H組Shannon指數(shù)高于DT組(P<0.05)，Simpson指數(shù)H和DT組間并沒有發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別。Shannon指數(shù)對(duì)群落的豐富度以及稀有OTU更敏感，而Simpson指數(shù)對(duì)均勻度和群落中的優(yōu)勢(shì)OTU更敏感。以上結(jié)果說明，與DT組相比H組菌群豐度、多樣性更高。

表1 兩組多樣性指數(shù)比較

注：aP=0.003，bP=0.006，cP=0.043

對(duì)兩組樣本菌群最豐富4個(gè)菌門的相對(duì)豐度進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)(圖1及表2)，Proteobacteria和Firmicutes在H組豐度明顯高于DT組(P<0.01)，Bacteroidetes和Acidobacteria在DT組豐度明顯高于H組(P<0.01)。對(duì)差異菌門中的菌屬進(jìn)行進(jìn)一步分析，通過LEfSe分析計(jì)算出兩組豐度差異值最大的菌屬，見圖2。發(fā)現(xiàn)Vibrio、Bifidobacterium、Megamonas、Streptomyces、Collinsella、Achromobacter等菌屬在DT組豐度明顯高于H組，Lactobacillus、Erysipelotrichaceae、Oscillospira、Caulobacter、Flavobacterium、Thermoactinomyces、Ruminococcus、Coprobacillus、Dorea等菌屬在H組豐度明顯高于DT組。

圖2 兩組間具有顯著差異的分類單元(橫坐標(biāo)則以條形圖展示對(duì)應(yīng)分類單元的LDA差異分析對(duì)數(shù)得分值，長(zhǎng)度越長(zhǎng)表明該分類單元的差異越顯著)

表2 兩組主要菌門間相對(duì)豐度比較

注：aP=0.013，bP=0.0001,cP=0.028,dP=0.0001

三、兩組在菌群代謝功能通路上的差異。

通過將現(xiàn)有的群落組成數(shù)據(jù)與已知的參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)相比較，并對(duì)原始數(shù)據(jù)中的微生物豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，通過PICRUSt軟件，根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中微生物代謝功能的類別對(duì)群落樣本進(jìn)行預(yù)測(cè)。由圖3可以預(yù)測(cè)，外來物質(zhì)降解與代謝、萜類化合物和聚酮化合物的代謝、其他氨基酸的代謝、脂質(zhì)代謝及氨基酸代謝等代謝功能在H組要高于DT組， 輔助因子與維生素代謝，聚糖生物合成與代謝，酶家族，能量代謝，碳水化合物代謝等代謝功能在DT組要高于H組。

圖3 群落樣本的代謝功能預(yù)測(cè)圖(圖形的長(zhǎng)度反映了該樣本中編碼相應(yīng)功能的基因豐度的高低)

討 論

過去一直認(rèn)為健康肺是無(wú)菌的，但隨著技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究顯示，肺部存在微生物群落，并且這些微生物群落與多種肺部疾病相關(guān)(哮喘、COPD、間質(zhì)性肺炎、支氣管擴(kuò)張等)[7-10]。在做肺部菌群研究時(shí)，許多實(shí)驗(yàn)樣本都是通過BAL和防污染毛刷獲取的，支氣管鏡通過上呼吸道進(jìn)入下呼吸道，存在上呼吸道污染下呼吸道樣本的風(fēng)險(xiǎn)，但也有研究顯示經(jīng)氣管鏡(經(jīng)鼻或經(jīng)口)取得的BAL中的菌群卻未受影響[11]。痰液作為一種無(wú)創(chuàng)的并且易獲取的標(biāo)本已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于許多肺部疾病中(如：COPD、哮喘、支氣管擴(kuò)張)[12-15]， 但痰液標(biāo)本更容易被污染。在手術(shù)室通過無(wú)菌手術(shù)獲取肺組織可以避免樣本經(jīng)過上呼吸道，是目前來說最能客觀反映肺部菌群的理想樣本，因此為了能客觀反映腺癌患者下呼吸道菌群結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，我們采用了收集手術(shù)室肺切除組織作為研究對(duì)象。

目前關(guān)于非疾病部位肺組織的主要菌門報(bào)道相似，主要是以Proteobacteria，F(xiàn)irmicutes，Bacteroidetes，Actinobacteria四大菌門為主。我們的研究也顯示肺組織中豐度最高的4個(gè)菌門是Proteobacteria(65%)，F(xiàn)irmicutes(18%)，Bacteroidetes(9%)和Acidobacteria(2%)。但關(guān)于菌屬的相關(guān)報(bào)道差異較大，Yu等[16]采用illumina測(cè)序方法，分析了165例腫瘤患者非腫瘤肺組織樣本，發(fā)現(xiàn)相對(duì)豐度較高核心菌屬：Acinebobacter(11.9%)，Comamonadaceae(11.6%)，Thermus(8.7%)，Pseudomonas(7.1%)，Oxalobacteraceae(5.5%)，Ralsonia(2.1%)，Staphylococcus(2.1%)，Streptococcus(2.0%)。而本研究顯示除了Acinebobacter、Ralsonia、Streptococcus三種菌屬豐度相似外，另外三種Burkholderia、Sediminibacterium、Lactobacillus菌屬豐度均較高，Comamonadaceae，Thermus及Oxalobacteraceae菌屬豐度較低。Bassis等[11]收集了28例健康人群的BALF，通過454焦磷酸測(cè)序的方法分析菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)健康人群BALF核心菌屬主要是：Prevetella、Streptococcus、Neisseria、Fusobacterium、Veillonella、Porphyromonas、Lactobacillus、Halomonas、Capnocytophaga、Actinomyces等。目前關(guān)于肺部菌群的研究大部分集中在西方人，而中國(guó)人肺部菌群研究相對(duì)較少。Hosgood等[17]收集了8例健康中國(guó)女性痰液樣本，通過454焦磷酸測(cè)序后分析，痰液中核心菌屬主要是：Streptococcus、Neisseria、Gemella、Granulicatella、Actinomyces、Veillonella、Prevotella等。可見非疾病部位肺組織在不同的研究中菌屬差異較大，考慮可能是受人群，生活區(qū)域，取材部位，樣本類型，16SrDNA靶測(cè)序區(qū)，數(shù)據(jù)庫(kù)和數(shù)據(jù)分析方法等影響。目前已有研究顯示非疾病部位菌群α多樣性與人口密度，空氣PM10顆粒物及家用煤燃燒相關(guān)[16-17]。

我們選取了12例肺葉支氣管開口處作為DT組，5例肺移植者健康肺氣管組織作為H組。早期有報(bào)道顯示非癌組織α多樣性要顯著高于癌組織，腺癌組織癌組織α多樣性要顯著高于鱗癌組織[16]。我們的研究顯示健康肺呼吸道內(nèi)菌群α多樣性要顯著高于腺癌患者呼吸道組織，并且在主要的菌門及菌屬豐度兩組間差異明顯。根據(jù)預(yù)測(cè)兩組在菌群代謝通路上亦有諸多不同，這些改變會(huì)不會(huì)像腸道菌群一樣，在癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程中起一定作用亦或是由于肺癌的進(jìn)展導(dǎo)致局部微環(huán)境的變化進(jìn)而影響肺部菌群，目前來看肺部菌群亦有這樣的趨勢(shì)，但還需要更多的研究來探討這一問題。

本研究的不足是病例數(shù)較少，在未來我們需要更大樣本的研究來分析中國(guó)人在肺內(nèi)不同位置的菌群結(jié)構(gòu)特征，另外其它的病理類型如鱗癌組織局部的菌群結(jié)構(gòu)特征是否又有所不同，本研究并未涉及。

本研究應(yīng)用高通量測(cè)序的方法，通過在無(wú)菌條件下收集樣本，分析了我國(guó)腺癌患者及健康肺下呼吸道內(nèi)細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)特征，以Proteobacteria(65%)、Bacteroidetes(18%)、Firmicutes(9%)和Acidobacteria(2%)菌門為主。另外本研究發(fā)現(xiàn)健康肺呼吸道內(nèi)菌群α多樣性要顯著高于腺癌患者呼吸道組織，并且在主要的菌門及菌屬豐度兩組間差異明顯。通過軟件預(yù)測(cè)兩組在菌群代謝通路上亦有諸多不同。這些菌群結(jié)構(gòu)的改變對(duì)肺腺癌到底有何影響，還需要我們進(jìn)一步研究。

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