夏炳江 侯明生 張 磊 胡松峰 王 寧

（1.浙江省紹興市中醫(yī)院，浙江 紹興 312000；2.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053）

椎間盤退變（IDD）被認為是引起下腰痛的主要原因［1］，嚴重影響人們的生活與工作。椎間盤作為人體最大的無血管組織，營養(yǎng)供應和物質(zhì)代謝有其獨有的特點，加上所要承受的特殊生物力學作用，使其成為人體內(nèi)最早發(fā)生退變的組織之一［2］。傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療椎間盤退變性疾病多從腎虛、血瘀及風寒濕外襲等立論，采用滋補肝腎、祛風散寒、活血化瘀、蠲痹通絡(luò)等方法［3-4］，但總體療效有待于進一步提高。課題組前期通過對中醫(yī)理論、文獻、臨床等方面進行研究，認為椎間盤退變性疾病的主要病機為“本虛標實，五臟氣血虛損為本，痰濁瘀血為標”，治療當以“五臟氣血同補”為主。五福飲源于明代名醫(yī)張景岳，由人參、熟地黃、當歸、白術(shù)、炙甘草組成，為“五臟氣血同補”的經(jīng)典代表方［5］。課題組應用五福飲加減治療椎間盤退變性疾病，包括頸椎病、盤源性腰痛等，其療效在臨床實踐中已得到了初步肯定，但其現(xiàn)代醫(yī)學作用機制尚不明確。故本實驗擬利用SD大鼠椎間盤退變模型，研究五福飲對椎間盤退變的防治作用及其對椎間盤聚蛋白聚糖與Ⅱ型膠原表達影響，以期闡明其防治椎間盤退變的可能作用機制，為臨床應用提供實驗室依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取48只12周齡的清潔級Sprague-Dawley（SD）大鼠作為實驗動物，體質(zhì)量（220±20）g，浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供 （實驗動物號：SYXK-浙-2008-0115）。所有大鼠均飼養(yǎng)在屏障環(huán)境內(nèi)，每籠飼養(yǎng)6只，飼養(yǎng)室室溫控制在（20±2）℃，自由進食進水。

1.2 主要儀器與試劑

DEPC水 （由北京康為世紀生物科技提供），Trizol提取液 （由上海生工提供），反轉(zhuǎn)錄試劑盒 （由大連TAKARA提供），定量試劑盒（由大連TAKARA提供），PCR所需引物合成（由上海生工提供），熒光定量PCR儀（由美國ABI提供），核酸分光光度計（NanoDrop2000C，由Thermo scientific公司提供），Micro-CT成像 （Bruker Microct NV）。

1.3 分組與造模方法

SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按隨機分組設(shè)計原則，將48只大鼠隨機分成3組，即空白對照組、退變模型組、五福飲干預組，每組16只。退變模型組與五福飲干預組SD大鼠行尾椎間盤退變造模，造模方法參照文獻［6］，即通過針刺損傷尾 5/6椎間盤（Co5/6）纖維環(huán)結(jié)合椎間盤內(nèi)注射腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘發(fā)炎癥的方法構(gòu)建尾椎間盤退變模型。造模后4周，每組隨機選取8只大鼠，通過造模椎間盤進行影像學、組織病理學及分子生物學檢測，以明確造模是否成功。試驗中所有SD大鼠在造模前均不存在先天性尾椎畸形及椎間盤退變等病理改變（影像學證實）。在試驗過程中，無大鼠意外死亡。造模后4周，退變模型組與五福飲干預組大鼠Co5/6椎間隙相對高度下降，HE染色顯示退變椎間盤表現(xiàn)，聚蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA表達水平降低，表明造模成功。

1.4 干預方法

五福飲組成：人參、熟地黃、當歸、白術(shù)、炙甘草。制備方法：本研究中的五福飲藥液采用水提法制備，將以上 5 味中藥飲片按 2∶3∶3∶2∶1 的比例混合，蒸餾水浸泡1 h，加入12倍量的水回流提取3次，每次1.5 h。水提物減壓濃縮至相對密度為1.05，再加入95%乙醇至含醇量為60%，醇沉24 h，回收含藥乙醇，減壓濃縮至2 g/mL，-20℃保存?zhèn)溆?。造模成功后各組開始進行藥物干預。五福飲干預組大鼠采用灌胃方式給藥（2 mL/100 g），空白對照組及退變模型組大鼠予以相應體積生理鹽水灌胃，每日1次，共8周。

1.5 標本采集及檢測

1.5.1 Micro-CT掃描及椎間盤相對高度測量 應用Micro-CT 掃描（掃描電壓：55 kV；掃描電流：455 μA；掃描曝光時間：250 ms）大鼠Co5/6椎間盤及其兩側(cè)椎體，掃描完成后，收集數(shù)據(jù)，應用相應配套圖像處理軟件進行三維重建及結(jié)果分析。參考文獻［7］方法測量Co5/6椎間盤相對高度：取前后位3D重建圖像，測量椎間盤寬度四等分位點兩側(cè)相鄰椎體及椎間盤高度，取其平均值。計算椎間盤高度指數(shù)（DHI）=椎間盤高度平均值/椎體高度平均值。平均椎間盤高度的變化表示為DHI百分比的變化。

1.5.2 椎間盤組織病理學 完整切取大鼠Co5/6椎間盤及其兩側(cè)部分椎體，4%多聚甲醛固定，48 h后利用14%EDTA脫鈣液脫鈣4周，常規(guī)脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片，HE染色。光鏡下觀察椎間盤組織形態(tài)學改變。

1.5.3 椎間盤聚蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA表達水平檢測 將大鼠Co5/6椎間盤完整取下，加入液氮冷凍后，迅速將其研磨成粉。加入Trizol液，采用一步法提取總RNA，檢測提取mRNA的濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒及相關(guān)引物使用說明書，加入相應劑量試劑進行PCR擴增。試驗所需引物序列見表1。每個樣本均重復測量2次，取其平均值。

表1 RT-PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠Co5/6椎間盤DHI比較

見表2。Micro-CT掃描顯示，造模后，大鼠Co5/6椎間隙高度降低，同時伴有兩側(cè)椎體不同程度骨贅增生。治療后，五福飲干預組大鼠Co5/6椎間盤相對高度與空白對照組比較，仍有下降（P＜0.05），但較退變模型組大鼠升高（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠Co5/6椎間盤形態(tài)學比較

見圖1?？瞻讓φ战M顯示大致正常的椎間盤組織。退變模型組顯示明顯退變的椎間盤組織。五福飲干預組顯示輕度退變的椎間盤組織。造模4周后，大鼠Co5/6椎間盤HE染色顯示明顯退變特征，包括髓核細胞排列紊亂、數(shù)量減少，外周纖維環(huán)排列紊亂、有裂隙。灌服五福飲8周后，大鼠Co5/6椎間盤HE染色雖亦表現(xiàn)出退變特征，但較退變模型組大鼠有所改善，可見較多排列尚均勻的髓核細胞，外周纖維環(huán)排列尚規(guī)律，裂隙少見。退變模型組大鼠在造模后12周時，表現(xiàn)出更明顯的椎間盤退變特征，即髓核細胞明顯減少，外周纖維環(huán)出現(xiàn)明顯的裂隙及斷裂。

表2 各組大鼠Co5/6椎間盤DHI比較（%，±s）

表2 各組大鼠Co5/6椎間盤DHI比較（%，±s）

與空白對照組同時期比較，△P＜0.05；與退變模型組同時期比較，▲P＜0.05。 下同。

空白對照組 8100.00 100.00退變模型組 858.24±10.25△ 51.36±11.65五福飲干預組 8 57.45±11.35△ 79.86±10.75△▲

圖1 各組大鼠造模4周后椎間盤結(jié)果（HE染色，50倍）

圖2 各組大鼠給藥8周后椎間盤結(jié)果（HE染色，50倍）

2.3 各組大鼠Co5/6椎間盤聚蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA表達水平比較

見表3。治療前退變模型組及五福飲干預組大鼠Co5/6椎間盤聚蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA較空白對照組大鼠均有明顯下降P＜0.05）。治療后，五福飲干預組大鼠Co5/6椎間盤聚蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA，與退變模型組比較，均有明顯提高（P＜0.05）。

表3 各組大鼠Co5/6椎間盤蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA表達比較（±s）

表3 各組大鼠Co5/6椎間盤蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA表達比較（±s）

組 別 時 間 聚蛋白聚糖 Ⅱ型膠原空白對照組 治療前 1.12±0.27 1.20±0.10（n＝8） 治療后 1.30±0.34 1.18±0.08退變模型組 治療前 0.70±0.04△ 0.71±0.06△（n＝8） 治療后 0.63±0.06△ 0.52±0.08△五福飲干預組 治療前 0.67±0.05△ 0.64±0.06△（n＝8） 治療后 1.06±0.09△▲ 0.90±0.08△▲

3 討 論

在治療椎間盤退變及其相關(guān)疾病過程中，中醫(yī)學積累了豐富的經(jīng)驗。課題組前期通過對中醫(yī)理論、文獻、臨床等方面進行研究，認為五臟氣血虧虛為其內(nèi)在病理基礎(chǔ)，五臟氣血虧虛，氣化無力，津液與血運行失常，聚而成痰、成瘀；而痰瘀內(nèi)停，可使經(jīng)脈痹阻，因虛致實，因?qū)嵵绿?，虛實夾雜構(gòu)成椎間盤退變性疾病本虛標實的病理過程。根據(jù)上述病因病機，課題組認為椎間盤退變性疾病治則當以“五臟氣血同補”為主。

五福飲處方來源于 《景岳全書·卷五十》，由人參（入心）、熟地黃（入腎）、當歸（入肝）、白術(shù)（入肺）、炙甘草（入脾）組成，主治五臟氣血虧損，是張景岳治療“五臟氣血虛損”的經(jīng)典代表方［8］。目前為止，關(guān)于五福飲研究的現(xiàn)代文獻報道較少，少量文獻表明其具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤及抗衰老等作用［5，8］。 目前，尚末見有報道五福飲抗椎間盤退變的文獻，但通過文獻分析，筆者可以發(fā)現(xiàn)組成該方的5味中藥對細胞外基質(zhì)均有一定的調(diào)控作用［9-13］，因此筆者推測五福飲復方可能通過調(diào)控椎間盤細胞外基質(zhì)起到預防椎間盤退變的作用。

本實驗研究結(jié)果表明，五福飲灌服8周后，大鼠造模椎間隙相對高度及組織學退變均有明顯改善，五福飲組大鼠與灌服生理鹽水組大鼠相比較，椎間盤聚蛋白聚糖與Ⅱ型膠原mRNA表達均有明顯提高，故筆者認為提高聚蛋白聚糖和Ⅱ型膠原表達可能是五福飲防治椎間盤退變的作用機制。

椎間盤的細胞外基質(zhì)中富含蛋白多糖和膠原蛋白［14-16］，其對維持椎間盤組織的水含量、滲透壓及張應力等起重要作用［17-18］。已有研究證實，椎間盤退變與細胞外基質(zhì)合成及分解代謝失去平衡有關(guān)，而分解代謝亢進在椎間盤退變病理過程中發(fā)揮更為關(guān)鍵的作用［19-20］。聚蛋白聚糖是椎間盤蛋白多糖中最主要的一種［21］。聚蛋白聚糖主要分布在髓核組織中，其能吸附水分子而維持組織的水含量及靜水壓，以利于發(fā)揮分散負荷，緩沖震蕩的生理功能。當髓核組織中聚蛋白聚糖減少時，以髓核為主的椎間盤基質(zhì)吸附水分子能力下降，基質(zhì)黏彈性下降，力學性能逐漸喪失，最終導致椎間盤退變發(fā)生［22］。Ⅱ型膠原蛋白亦是椎間盤發(fā)揮其功能的主要成分［18］，Ⅱ型膠原富含羥賴氨酸殘基，能使蛋白多糖和水分子聚集并聯(lián)接成網(wǎng)，抵抗蛋白多糖及水分子所產(chǎn)生的張力［23］。隨著椎間盤退變，膠原類型與數(shù)量發(fā)生轉(zhuǎn)變，Ⅱ型膠原的含量逐漸減少，該變化與椎間盤退變程度呈正相關(guān)［24］。

綜上所述，在“五臟氣血同補”基本治則的指導下，應用五福飲可有效防治大鼠椎間盤退變，提高聚蛋白聚糖與Ⅱ型膠原表達可能是其作用機制。

［1］Freemont AJ.The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain［J］.Rheumatology，2009，48（1）：5-10.

［2］黃吉軍，邵增務(wù)，熊蠡茗.細胞老化與椎間盤退變［J］.國際骨科學雜志，2009，30（4）：226-228.

［3］莫偉，許金海，葉潔，等.腰椎間盤突出癥中醫(yī)治療方法的研究進展［J］.中國中醫(yī)急癥，2016，25（3）：474-476.

［4］王小平.論《內(nèi)經(jīng)》確立五臟概念的文化基礎(chǔ)［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2013，31（6）：1227-1229.

［5］張紅玉，楊鋒，王波波，等.五福飲增強化療藥抗腫瘤作用及保護骨髓造血功能的實驗研究［J］.浙江中醫(yī)藥大學學報，2014，38（6）：682-685.

［6］夏炳江，張磊，胡松峰，等.纖維環(huán)穿刺結(jié)合TNF-α注射構(gòu)建大鼠尾椎間盤退變模型的實驗研究［J］.中國中醫(yī)急癥，2017，26（7）：1150-1154.

［7］Keorochana G，Johnson JS，Taghavi CE，et al.The effect of needle size inducing degeneration in the rat caudal disc：evaluation using radiograph，magnetic resonance imaging，histology， and immunohistochemistry［J］.Spine J，2010，10（11）：1014-1023.

［8］龐浩，劉祥準.五福飲對柔道運動員抗疲勞效果的研究［J］.中醫(yī)臨床研究，2014，6（34）：1-3，6.

［9］謝席勝，劉衡川，樊均明，等.人參皂甙Rbl對轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導的腎小管上皮細胞p47phox的表達及細胞外基質(zhì)的影響［J］.四川大學學報：醫(yī)學版，2009，40（1）：106-110.

［10］李廣波，秦娜，林瑞霞，等.地黃提取物對多柔比星腎病大鼠腎臟的保護作用機制［J］.實用兒科臨床雜志，2010，25（23）：1815-1818.

［11］王艷琴.當歸多糖對肺纖維化大鼠肺功能、細胞外基質(zhì)及病理形態(tài)學的影響［D］.蘭州：蘭州大學，2010.

［12］王郁金，蘇衍進，鄭廣娟.白術(shù)揮發(fā)油對小鼠H22肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移模型的影響［J］.現(xiàn)代中醫(yī)藥，2009，29（4）：74-75.

［13］寧士龍.RECK蛋白在異甘草素抑制乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用［D］.南京：南京醫(yī)科大學，2016.

［14］Marchand F，Ahmed AM.Investigation of the laminate structure of lumbar disc anulus fibrosus［J］.Spine，1990，15（5）：402-410.

［15］Lotz JC.Mechanobiology of the intervertebral disc［J］.Biochem Soc Trans，2002，30（6）：853-858.

［16］Ahsan R.Biochemical and morphological changes in herniated human intervertebral disc［J］.J Orthop Sci，2001，6（6）：510-508.

［17］Watanabe，H，Y.Yamada，and K.Kimata， Roles of aggrecan，a large chondroitin sulfate proteoglycan，in cartilage structure and function［J］.J Biochem，1998，124（4）：687-693.

［18］Scott JE.Proteoglycan： collagen interactions and subfibrillar structure in collagen fibrils.Implications in the development and ageing of connective tissues ［J］.J Anat，1990，169：23-35.

［19］Urban MR.Intervertebral disc composition in neuromuscular scoliosis：changes in cell density and glycosaminoglycan concentration at the curve apex［J］.Spine，2001， 26（6）：610-617.

［20］Roberts S.1991 Volvo Award in basic sciences.Collagen types around the cells of the intervertebral disc and cartilage end plate： an immunolocalization study［J］.Spine，1991，16（9）：1030-1038.

［21］Luo W，Guo C，zheng J，et a1.Aggrecan from start to finish［J］.J Bone Miner Metab，2000，18（2）：51-56.

［22］熊曉芊，邵增務(wù)，楊述華.聚集蛋白聚糖與椎間盤退變的研究進展［J］.中國脊柱脊髓雜志，2005，15（1）：54-57.

［23］Bradford DS，CooperKM，Oegema TR.Chymopapain，chemonucleolysis， and nucleus pulposus regeneration［J］.J Bone Joint Surg Am，1983，65（9）：1220-1231.

［24］Takegami K，An HS，Kumano F，et al.Osteogenic protein-1 is most effective in stimulating nucleus pulposus an annulus fibrosus cells to repair their matrix after chondroitinase ABC-induced in vitro chemonucleolysis［J］.Spine J，2005，5（3）：231-238.