汪慧超 錢 宇 薛秀恒 徐霞紅

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院1，合肥 230036) (安徽省農(nóng)產(chǎn)品加工工程實(shí)驗(yàn)室;皖江合肥農(nóng)產(chǎn)品加工研究院2，合肥 230036)

甘油二酯(diacylglycerol，DG)，是一種甘油骨架上只有兩個高級脂肪酸的油脂，屬于一般公認(rèn)安全(GRAS)物質(zhì)[1]，在天然油脂中含量很低。1,3-甘油二酯為甘油二酯兩種不同異構(gòu)體中的一種，脂肪酸?；c甘油骨架中羥基形成間隔酯鍵。研究表明，1,3-甘油二酯具有降低血脂[2-3]、緩解糖尿病[4]、抗氧化[5]等作用。在美國、日本等國，1,3-甘油二酯已被允許作為烹調(diào)用油或食品添加劑使用[6]。但在國內(nèi)關(guān)于1,3-甘油二酯在食品中應(yīng)用的報(bào)道較少，且1,3-甘油二酯極易被氧化，不易貯藏，對其在食品中的應(yīng)用造成很大的影響。因此，有必要使用特殊的方法，提高1,3-甘油二酯的抗氧化性，保證其在食品中的活性成分不被破壞。

納米乳液主要是由水、脂溶性芯材、水溶性壁材和乳化劑等組成成分，按一定比例在特定條件下混合形成的分散體系，對于易于氧化水解的功效成分具有良好的保護(hù)作用，還可提高其生物利用度。水溶性壁材主要有蛋白質(zhì)、多糖等，而脂溶性芯材主要有脂溶性維生素、營養(yǎng)素、精油、風(fēng)味油脂等。納米乳液的制備可分為高能乳化法和低能乳化法，高能乳化法[7]主要包括高壓均質(zhì)法、高壓微射流和超聲波法，而低能乳化法[8]主要包括自發(fā)乳化法和相轉(zhuǎn)變法。高能乳化法是制備納米乳液最常用的方法，可用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，且適用于大多數(shù)材料，而高壓均質(zhì)法是高能乳化法中使用最普遍的一種。

本研究采用高壓均質(zhì)法，以乳清蛋白為壁材，1,3-甘油二酯為芯材，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化乳清蛋白-甘油二酯納米乳液的制備，并對其表面性質(zhì)、表征及溫度、氧化、貯藏穩(wěn)定性進(jìn)行研究，為乳清蛋白-甘油二酯納米乳液在食品中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清蛋白粉：美國唐瑞斯食品物料公司；蔗糖酯SE-11：河南千志商貿(mào)有限公司；正己烷(色譜純)、異丙醇(色譜純)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；富含1,3-甘油二酯乳脂：實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 主要儀器與設(shè)備

高速分散器：上海FLUKO有限公司；超高壓納米均質(zhì)機(jī)：德國APV2000公司；Zeta電位及納米粒度測定儀：英國Malvern公司；OXITEST油脂氧化分析儀：意大利VELP公司；高效液相色譜儀：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白-甘油二酯納米乳液的制備

采用高壓均質(zhì)法制備納米乳液。將乳清蛋白粉加入蒸餾水中攪拌至完全溶解，制得乳清蛋白溶液；再將乳脂甘油二酯與乳化劑蔗糖酯混合，在50 ℃水浴中攪拌直至完全溶解，得到混合物；然后將乳清蛋白溶液緩慢倒入混合物中，邊倒邊攪拌，得到混合乳液；最后將混合乳液2 000 r/min高速分散3 min，并在超高壓納米均質(zhì)機(jī)中進(jìn)行均質(zhì)，得到乳清蛋白-甘油二酯納米乳液。

1.3.2 乳清蛋白-甘油二酯納米乳液制備的單因素實(shí)驗(yàn)

按操作步驟制備乳清蛋白-甘油二酯納米乳液，以納米乳液的粒徑和包埋率為綜合評價(jià)指標(biāo)，分別考察不同壁材濃度(占蒸餾水的百分比：5%、10%、15%、20%、25%)、不同壁芯比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)、不同乳化劑添加量(占總固形物含量的百分比：0，2%、4%、6%、8%)、不同均質(zhì)壓力(30、60、90、120、150 MPa)、不同均質(zhì)循環(huán)次數(shù)(2、6、10、14、18)對納米乳液制備的影響。

1.3.3 乳清蛋白-甘油二酯納米乳液制備的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

為確定乳清蛋白-甘油二酯納米乳液的最佳配方，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定高壓均質(zhì)的壓力與循環(huán)次數(shù)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，以壁材濃度、壁芯比、乳化劑添加量為因素，以包埋率響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化乳清蛋白-甘油二酯納米乳液制備的工藝參數(shù)，因素水平編碼如表1所示。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表

1.3.4 乳清蛋白-甘油二酯納米乳液的評價(jià)指標(biāo)1.3.4.1 納米乳液粒徑及Zeta電位的測定

采用Zeta電位及納米粒度測定儀測定乳清蛋白-甘油二酯納米乳液的粒徑及表面電位。

1.3.4.2 納米乳液包埋率的測定

采用高效液相色譜儀分別對納米乳液的表面油及總油進(jìn)行測定，并按公式計(jì)算。

表面油的測定：取制備好的納米乳液，加入正己烷/異丙醇(15∶1)，反復(fù)萃取后合并有機(jī)相并定容，用高效液相色譜法測定乳脂甘油二酯含量。

總油的測定：將制備好的納米乳在超聲波細(xì)胞破碎儀中破乳后，加入正己烷/異丙醇(15∶1)，反復(fù)萃取后合并有機(jī)相并定容，用高效液相色譜測定乳脂甘油二酯含量。

高效液相色譜條件：流動相為正己烷/異丙醇(15∶1)，流速1 mL/min，柱溫35 ℃，色譜柱為Luna silica C18(5 μm，250×4.6 mm，Phenomenex)。使用示差檢測器進(jìn)行檢測，檢測器溫度35 ℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過峰的峰面積來定量測定。

1.3.5 乳清蛋白-甘油二酯納米乳液的質(zhì)量評價(jià)1.3.5.1 透射電鏡

采用JEM-100SX型透射電鏡對納米乳液的粒徑及分布情況進(jìn)行測定。取一定量的樣品滴于干凈的銅網(wǎng)表面，經(jīng)1%磷鎢酸染色后自然風(fēng)干，并利用透射電鏡進(jìn)行觀察。

1.3.5.2 紅外光譜

采用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行測定，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.3.5.3 溫度穩(wěn)定性

將制備好的納米乳液分別放置于20、30、40、50、60、70、80、90 ℃水浴鍋中加熱30 min，然后在室溫中靜置12 h，測定納米乳液的粒徑和包埋率。

1.3.5.4 氧化穩(wěn)定性

利用OXITEST油脂氧化分析儀對乳清蛋白-甘油二酯納米乳液的氧化穩(wěn)定性進(jìn)行測定。

1.3.5.5 貯藏穩(wěn)定性

將制備好的納米乳液分別放置于4 ℃(冷藏)、25 ℃(常溫)、37 ℃(體溫)貯藏1個月，每隔5 d取樣測定其包埋率，研究不同貯藏溫度對納米乳液穩(wěn)定性的影響。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Design-expert 8.05和Origin Pro 9.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 壁材濃度對納米乳液制備的影響

在固定壁芯比為3∶1，乳化劑添加量為4%，均質(zhì)壓力為90 MPa，均質(zhì)循環(huán)次數(shù)為10次時，不同壁材濃度對納米乳液制備的影響如圖1所示。從圖1可以看出，隨著壁材濃度的升高，納米乳液的粒徑先減小后增大，包埋率先增大后減小，在壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時，粒徑與包埋率均達(dá)到最值。由于乳清蛋白本身具有一定的乳化性，隨著壁材濃度的升高，納米乳液的乳化作用增強(qiáng)，有利于納米乳液中納米顆粒的形成，包埋率較高，當(dāng)壁材濃度過高時，體系黏度過大，不利于分散，導(dǎo)致包埋率降低，粒徑增大。因此，選擇15%為壁材最佳質(zhì)量濃度。

圖1 壁材濃度對納米乳液制備的影響

2.1.2 壁芯比對納米乳液制備的影響

在選擇壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的基礎(chǔ)上，固定乳化劑添加量為4%，均質(zhì)壓力為90 MPa，均質(zhì)循環(huán)次數(shù)為10次時，不同壁芯比對納米乳液制備的影響如圖2所示。從圖2可以看出，隨著壁芯比的增大，納米乳液的粒徑先迅速減小后緩慢減小，包埋率先增大后減小，在壁芯比為2∶1～4∶1時包埋率增加趨勢最大，在壁芯比為4∶1時，包埋率達(dá)到最大值。開始時，芯材過多，壁材不足，不能很好的包被乳脂甘油二酯，粒徑較大，包埋率較低。隨著壁芯比的增大，芯材含量逐漸減少，納米乳液粒徑逐漸減小，包埋率逐漸升高，包被效果較好。但當(dāng)壁芯比過大時，芯材含量過少，反而導(dǎo)致包埋率的下降。因此，壁芯比為4∶1時，納米乳液效果最佳。

圖2 壁芯比對納米乳液制備的影響

2.1.3 乳化劑添加量對納米乳液制備的影響

在選擇壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%、壁芯比為4∶1的基礎(chǔ)上，固定均質(zhì)壓力為90 MPa，均質(zhì)循環(huán)次數(shù)為10次時，不同乳化劑添加量對納米乳液制備的影響如圖3所示。隨著乳化劑的增多，納米乳液的粒徑先減小后增大，包埋率先升高后降低，均在乳化劑添加量為4%時達(dá)到最值。添加一定量的乳化劑能提高納米乳液的乳化性能，有助于納米乳液中納米顆粒的形成，但添加量過多時，反而導(dǎo)致粒徑增大，包埋率降低。因此以乳化劑添加量4%為最適添加量。

圖3 乳化劑添加量對納米乳液制備的影響

2.1.4 均質(zhì)壓力對納米乳液制備的影響

在選擇壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%、壁芯比為4∶1、乳化劑添加量4%的基礎(chǔ)上，固定均質(zhì)循環(huán)次數(shù)為10次時，不同均質(zhì)壓力對納米乳液制備的影響如圖4所示。從圖4可以看出，隨著均質(zhì)壓力的增大，納米乳液的粒徑先迅速減小，后緩慢增大，在90 MPa時粒徑最小。納米乳液包埋率先升高后降低，也在90 MPa時達(dá)到最大值。均質(zhì)壓力的增大，可使納米乳液在超高壓均質(zhì)過程中混合得更均勻，被分散成更小的顆粒，使納米乳液粒徑減小，包埋率增加。但均質(zhì)壓力過高時，可能會導(dǎo)致納米乳液被破壞，且部分納米顆粒會發(fā)生聚合，反而導(dǎo)致粒徑增大，包埋率降低。因此90 MPa為最佳的均質(zhì)壓力。

圖4 均質(zhì)壓力對納米乳液制備的影響

2.1.5 均質(zhì)循環(huán)次數(shù)對納米乳液制備的影響

在選擇壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%、壁芯比為4∶1、乳化劑添加量4%、均質(zhì)壓力為90 MPa的基礎(chǔ)上，不同均質(zhì)循環(huán)次數(shù)對納米乳液制備的影響如圖5所示。由圖5可知，隨著循環(huán)次數(shù)的增多，納米乳液的粒徑開始時迅速減小，后減小速度極慢，基本保持平衡。包埋率先增加，后逐漸減小，在循環(huán)次數(shù)為6次時，包埋率最大。高壓均質(zhì)循環(huán)一定的次數(shù)可使納米乳液混合更加均勻，粒徑分布更加集中，包埋效果更好。但循環(huán)次數(shù)過多時，機(jī)器溫度過高，會對納米乳液造成一定的破壞，導(dǎo)致包埋率迅速降低。綜合考慮，最佳高壓均質(zhì)循環(huán)次數(shù)為6次。

圖5 均質(zhì)循環(huán)次數(shù)對納米乳液制備的影響

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken design實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以壁材濃度、壁芯比、乳化劑添加量為自變量，乳清蛋白-甘油二酯納米乳液的包埋率為因變量，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化乳清蛋白-甘油二酯納米乳液的配方，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到響應(yīng)面回歸模擬方程：

Y=73.94+5.26A-4.35B-2.66C+2.35AB-1.17AC-5BC-11.26A2-3.08B2-25.16C2

由表3可知，模型的P值<0.000 1，說明該模型極顯著，失擬項(xiàng)P值為0.068 1>0.05，不顯著，說明該模型能很好的擬合實(shí)驗(yàn)的真實(shí)情況，可以用于乳清蛋白-甘油二酯納米乳液工藝的優(yōu)化。通過方差分析結(jié)果可知，壁材濃度、壁芯比及乳化劑添加量對納米乳液包埋率的影響均極顯著。而在交互作用中，壁材濃度和壁芯比的交互作用顯著，壁芯比及乳化劑添加量的交互作用極顯著。

表3 回歸方程方差分析表

注:**表示差異極顯著；*表示差異顯著。

2.2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素間交互作用分析

將響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中一個因素設(shè)為零水平，其他兩個因素交互作用的響應(yīng)面及等高線圖見圖6和圖7。

圖6為壁材濃度和壁芯比交互作用對乳清蛋白-甘油二酯納米乳液包埋率的影響。當(dāng)壁材濃度固定時，隨著壁芯比的增大，納米乳液包埋率先升高后降低；當(dāng)壁芯比保持一定時，隨著壁材濃度的增加，納米乳液包埋率也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。壁材濃度和壁芯比交互作用等高線圖呈橢圓形，表明在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的壁材濃度和壁芯比區(qū)間內(nèi)，存在最大交互區(qū)間。

圖7為壁芯比和乳化劑添加量交互作用對乳清蛋白-甘油二酯納米乳液包埋率的影響。從圖7中可以看出，響應(yīng)面坡度較陡，壁芯比和乳化劑添加量交互作用極顯著。當(dāng)壁芯比保持一定時，隨著乳化劑添加量的增加，納米乳液包埋率呈先升高后降低的趨勢；當(dāng)壁芯比固定時，隨著乳化劑添加量的增大，納米乳液包埋率也呈現(xiàn)先升高后降低。壁芯比和乳化劑添加量交互作用等高線圖也呈橢圓形，表明在實(shí)驗(yàn)設(shè)定壁芯比和乳化劑添加量區(qū)間內(nèi)，存在最大交互區(qū)間。

圖6 壁材濃度和壁芯比交互作用響應(yīng)面圖及等高線圖

圖7 壁芯比和乳化劑添加量交互作用響應(yīng)面圖及等高線圖

2.2.3 最佳工藝條件的確定及驗(yàn)證

根據(jù)模型預(yù)測結(jié)果，乳清蛋白-甘油二酯納米乳液的最佳工藝條件為：壁材質(zhì)量濃度15.83%，壁芯比3.35∶1，乳化劑添加量4.02%。按上述條件制備乳清蛋白-甘油二酯納米乳液，經(jīng)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，制得的納米乳液的包埋率為75.5%，與理論值75.776 5%接近，實(shí)際測定值與預(yù)測的理論值之間相對誤差較小，因此，基于響應(yīng)面法得到的工藝條件是可行的，有實(shí)用價(jià)值。

2.3 納米乳液粒徑及Zeta電位的測定

通過Zeta電位及納米粒度測定儀對乳清蛋白-甘油二酯納米乳液進(jìn)行測定，其粒徑及分布情況如圖8所示。由圖8可知，納米乳液粒徑呈正態(tài)分布，大部分集中在100 nm左右。乳清蛋白-甘油二酯納米乳液Zeta電位、平均粒徑及PDI分散指數(shù)見表4。由表4可知，納米乳液的Zeta電位在-23 mV左右，帶負(fù)電荷，平均粒徑在142 nm左右，PDI指數(shù)在0.238左右，表明制得的納米乳液粒徑分布均勻。

圖8 乳清蛋白-甘油二酯納米乳液粒徑及分布情況 表4 納米乳液Zeta電位、平均粒徑及PDI分散指數(shù)

項(xiàng)目Zeta電位/mV平均粒徑/nmPDI1-22.79142.20.2342-23.06140.50.2383-23.70143.70.2394-23.77141.80.2385-23.55142.60.239

2.4 納米乳液的表征

2.4.1 透射電鏡

乳清蛋白及納米乳液的透射電鏡結(jié)果如圖7所示。從圖7中可以看出，經(jīng)過均質(zhì)處理后的乳清蛋白粒徑較小，僅為幾十納米，形狀不規(guī)則。乳清蛋白-甘油二酯納米乳液呈現(xiàn)近似球形，中間芯材甘油二酯部分較亮，粒徑為80～200 nm左右，納米乳液中納米顆粒具有明顯的海島狀殼核結(jié)構(gòu)，表明包被效果較好。

圖9 乳清蛋白及納米乳液的透射電鏡圖

2.4.2 紅外光譜

圖10 納米乳液(a)、乳清蛋白(b)及甘油二酯(c)的紅外光譜圖

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.5.1 溫度穩(wěn)定性

不同溫度處理對納米乳液粒徑及包埋率的影響如圖11所示。隨著處理溫度的升高，納米乳液的粒徑略微升高，但是總體基本保持平衡；包埋率逐漸降低，在20～80 ℃下降速度較慢，但在80 ℃之后包埋率下降迅速，可能是由于處理溫度較高，對納米乳液造成一定的破壞，導(dǎo)致包埋率迅速降低。因此，在80 ℃以下，納米乳液相對較穩(wěn)定。

圖11 不同溫度處理對納米乳液粒徑及包埋率的影響

2.5.2 氧化穩(wěn)定性

納米乳液的氧化穩(wěn)定性經(jīng)OXITEST油脂氧化儀測試結(jié)果如圖12所示。從圖12中可看出，乳脂甘油二酯在較短的時間內(nèi)急劇氧化，在20 h趨于氧化完全，20 h以后氧壓下降極緩慢，基本處于平衡狀態(tài)。而經(jīng)超高壓納米均質(zhì)處理的乳清蛋白-甘油二酯納米乳液氧化速度則非常緩慢，氧化穩(wěn)定性較好，經(jīng)400 h氧化，氧壓只下降1.5左右，仍未被氧化完全。因此，乳清蛋白-甘油二酯納米乳液能提高甘油二酯的氧化穩(wěn)定性，利于保藏。

圖12 納米乳液的氧化穩(wěn)定性

2.5.3 貯藏穩(wěn)定性

不同貯藏溫度對納米乳液包埋率的影響如圖13所示。由圖13可知，在30 d貯藏時間內(nèi)，隨著時間的延長，納米乳液包埋率逐漸降低。但溫度越高，包埋率下降速度越快，溫度較低時，包埋率下降緩慢。說明貯藏溫度對納米乳液品質(zhì)的影響較大，長期高溫貯藏會導(dǎo)致納米乳液被迅速破壞，包埋率降低，影響納米乳液的使用及作用效果。因此，該納米乳液應(yīng)在4 ℃低溫貯藏。

圖13 不同貯藏溫度對納米乳液包埋率的影響

3 結(jié)論

乳清蛋白-甘油二酯納米乳液的最佳工藝條件為：壁材質(zhì)量濃度15.83%，壁芯比3.35∶1，乳化劑添加量4.02%，此時，納米乳液的包埋率最高，為75.5%。納米乳液帶負(fù)電，分布均勻，粒徑在142 nm左右，有明顯的殼核結(jié)構(gòu)，包被效果較好。納米乳液在80 ℃以下具有較好的穩(wěn)定性，且能有效延緩甘油二酯的氧化，最佳貯藏溫度為4 ℃。

[1]WATANABE T,SUGIURA M, Sato M, et al. Diacylglycerol production in a packed bed bioreactor[J]. Process Biochemistry, 2005, 40(2):637-643

[2]MURASE T, MIZUNO T, OMACHI T, et al. Dietary diacylglycerol suppresses high fat and high sucrose diet-induced body fat accumulation in C57BL/6J mice[J]. Journal of Lipid Research, 2001, 42(3): 372-378

[3]MAKI K C, DAVIDSON M H, TSUSHIMA R, et al. Consumption of diacylglycerol oil as part of a reduced-energy diet enhances loss of body weight and fat in comparison with consumption of a triacylglycerol control oil[J]. The American journal of clinical nutrition, 2002, 76(6): 1230-1236

[4]李漸鵬, 杜方嶺, 閆永恒, 等. 甘油二酯對2型糖尿病腎病大鼠腎臟保護(hù)機(jī)制[J]. 營養(yǎng)學(xué)報(bào),2016,38(2): 147-151 LI J P, DU F L, YAN Y H, et al.The protective effects of diacylglycerol on diabetic nephropathy in type 2 diabetic rats[J]. Journal of nutrition, 2016, 38(2):147-151

[5]閆雪彥. 甘油二酯對大鼠血脂和抗氧化水平影響的實(shí)驗(yàn)研究[D].青島：青島大學(xué),2011 YAN X Y. Study of diacylglycerol’s effect on the blood fat and antioxidation of rats[D]. Qingdao: Qingdao University, 2011[6]KIMURA H, BURDOCK G A. Chronic study of diacylglycerol oil in rats [J]. Food and Chemical Toxicology, 2001, 39:317-329[7]GUTIERREZ J M, GONZALEZ C, MAESTRO A, et al. Nano-emulsions: new applications and optimization of their preparation[J]. Current Opinion in Colloid & Interface Science, 2008, 13(4):245-251

[8]FERNANDEZ P, ANDRE V, RIEGER J, et al. Nano-emulsion formation by emulsion phase inversion[J]. Colloids and Surfaces A-Physicochemical and Engineering Aspects, 2004, 251(1-3):53-58.