盧宏全，錢(qián)小英，黃國(guó)定，潘敏麗

(1海南省西部中心醫(yī)院，海南儋州571700；2海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院)

胰腺癌是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，具有惡性程度高、進(jìn)展快、發(fā)現(xiàn)晚、預(yù)后差等特點(diǎn)[1]，與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)密切相關(guān)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA) 是指一類轉(zhuǎn)錄本>200個(gè)核苷酸的RNA，可通過(guò)表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等方式在許多疾病中發(fā)揮重要作用[2]。小泛素樣修飾蛋白1假基因3(SUMO1P3)是新近發(fā)現(xiàn)的一種LncRNA，已有研究[3～5]發(fā)現(xiàn)其在胃癌、肝癌、膀胱癌中高表達(dá)，且影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。2011年2月～2017年2月，我們觀察了SUMO1P3在胰腺癌組織中的表達(dá)情況，并以小干擾RNA(siRNA)技術(shù)沉默胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1中SUMO1P3的表達(dá)，探討對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等行為的影響及其分子機(jī)制，為胰腺癌診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 胰腺癌及癌旁組織獲取和預(yù)后隨訪 收集2011年2月～2013年12月手術(shù)切除的胰腺癌手術(shù)標(biāo)本及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織42例，切除后均立即存放于液氮中并于液氮罐中保存?；颊咧心?7例、女15例，年齡36～65歲；腫瘤位于胰頭28例、胰體和胰尾14例，瘤體長(zhǎng)徑(1.3±0.6)cm；組織中高分化28例、低分化14例，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期27例、Ⅲ～Ⅳ期15例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例。術(shù)后均隨訪15～50個(gè)月，計(jì)算總體生存期(OS)。

1.2 胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng) PANC-1來(lái)源于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 胰腺癌細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于6孔板，隨機(jī)分為沉默組和對(duì)照組。待細(xì)胞生長(zhǎng)到60%～70%融合時(shí)，按Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)分別轉(zhuǎn)染SUMO1P3-siRNA、空載質(zhì)粒NC-siRNA。轉(zhuǎn)染后6 h換成含10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。以上質(zhì)粒由上海吉瑪公司合成構(gòu)建。

1.4 胰腺癌組織及細(xì)胞中SUMO1P3檢測(cè) 采用qRT-PCR法。從胰腺癌組織及細(xì)胞中提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，在20 μL體系中加入2 μg RNA進(jìn)行cDNA合成。qRT-PCR采用SYBR Green PCR Master Mix， SUMO1P3上游引物5′-ACTGGGAATGGAGGAAGA-3′、 下游引物5′-TGAGAAAGGATTGAGGGAAAAG-3′，內(nèi)參GAPDH上游引物5′-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′、下游引物 5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3′。取適量cDNA作為模板，在20 μL體系中進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)待測(cè)樣本設(shè)置3個(gè)平行樣本，PCR反應(yīng)在定量PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)，以2-ΔΔCt計(jì)算SUMO1P3相對(duì)表達(dá)量。

1.5 胰腺癌細(xì)胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。將兩組細(xì)胞以2×103/孔接種于96孔板，分別于24、48、72、96 h時(shí)加入CCK-8 10 μL/100 μL；37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)70 min后，用全波段酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的光密度(OD)值，以此表示細(xì)胞增殖能力。

1.6 胰腺癌細(xì)胞遷移能力觀察 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。將兩組細(xì)胞以2×103/孔接種于6孔板，用10 μL經(jīng)消毒的白色槍頭在6孔板垂直劃痕，用無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；分別于0、24 h照相，測(cè)各組劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞劃痕愈合率。

1.7 胰腺癌細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。將Matrigel膠均勻涂于Transwell小室內(nèi)，37 ℃靜置30 min。收集轉(zhuǎn)染48 h 的兩組細(xì)胞，在Transwell小室的上室接種無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基重懸的懸液200 μL(1×105/ mL)，下室加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基800 μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室,擦去小室底部未穿過(guò)基底膜的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定后結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡下每個(gè)小室隨機(jī)選取10 個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過(guò)小室基底膜的細(xì)胞，以此表示細(xì)胞侵襲能力。

1.8 胰腺癌細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。收集轉(zhuǎn)染后48 h 的兩組細(xì)胞，提取總蛋白；BCA法測(cè)定蛋白濃度后，各取30 μg 蛋白上樣；10%的SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h；分別用抗E-cadherin、N-cadherin和β-catenin 抗體(CST，1∶1 000) 4 ℃孵育過(guò)夜，再用相應(yīng)的熒光二抗(1∶10 000)室溫下孵育1 h；PBST洗膜10 min×3 次，放于顯影儀下進(jìn)行顯影。采用Image Lab 檢測(cè)條帶灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參β-actin灰度比值表示該蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌及癌旁組織中SUMO1P3表達(dá)比較 SUMO1P3在胰腺癌組織中相對(duì)表達(dá)量為7.326±0.884，高于癌旁組織的1.553±0.206(P<0.05)。

2.2 SUMO1P3表達(dá)與胰腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 SUMO1P3相對(duì)表達(dá)量與胰腺癌患者的年齡、性別、癌組織分化程度及腫瘤部位無(wú)明顯相關(guān)(P均>0.05),與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 SUMO1P3表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 SUMO1P3表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系 取胰腺癌組織SUMO1P3相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)，高表達(dá)者25例、低表達(dá)者17例；SUMO1P3高表達(dá)者OS為16.19個(gè)月，低于低表達(dá)者的27.78個(gè)月(P<0.05)。

2.4 兩組PANC-1細(xì)胞中SUMO1P3表達(dá)比較 沉默組PANC-1細(xì)胞中SUMO1P3相對(duì)表達(dá)量為2.26±0.13，低于對(duì)照組的4.13±0.27(P<0.05)。

2.5 沉默SUMO1P3對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組比較，沉默組轉(zhuǎn)染各時(shí)點(diǎn)細(xì)胞OD450值降低(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 沉默SUMO1P3對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.6 沉默SUMO1P3對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移的影響 沉默組細(xì)胞劃痕愈合率為21.83%，低于對(duì)照組的54.29%(P<0.05)。

2.7 沉默SUMO1P3對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲的影響 沉默組穿膜細(xì)胞(76±9)個(gè)，低于對(duì)照組的(167±12)個(gè)(P<0.05)。

2.8 沉默SUMO1P3對(duì)胰腺癌細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，沉默組E-cadherin表達(dá)增加而N-cadherin、β-catenin表達(dá)降低(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 沉默SUMO1P3對(duì)胰腺癌細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白 表達(dá)的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討論

目前，胰腺癌惡性程度高，且發(fā)病率和病死率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。胰腺癌早期診斷率和手術(shù)切除率較低，易轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，對(duì)傳統(tǒng)放化療不敏感，預(yù)后差[6]。因此，進(jìn)一步研究胰腺癌的生物學(xué)特性及其發(fā)生發(fā)展的分子調(diào)控機(jī)制，尋找診斷、治療的生物靶點(diǎn)具有重要意義。

LncRNA是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，最初因其缺乏編碼蛋白的能力而被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，不具有生物學(xué)功能。但近年來(lái)大量研究表明，LncRNA可以通過(guò)表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等方式在機(jī)體生理、病理過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。LncRNA種類繁多，作用機(jī)制復(fù)雜。例如：LncRNA-PVT1可與miR-488之間以ceRNA調(diào)控方式促進(jìn)胰腺癌增殖、侵襲[7]；LncRNA-ROR可促進(jìn)EMT發(fā)生進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移[8]；LncRNA-MALAT可以通過(guò)增加SOX2表達(dá)進(jìn)而維持胰腺癌干細(xì)胞的穩(wěn)定[9]。

SUMO1P3在膀胱癌、胃癌、肝癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)量與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等臨床病理特征有關(guān)[3～5]，且SUMO1P3能夠促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移、抑制膀胱癌細(xì)胞凋亡[5]。目前，SUMO1P3在胰腺癌組織中的表達(dá)及其作用機(jī)制均不明確。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，SUMO1P3在胰腺癌組織高表達(dá)，胰腺癌組織中的SUMO1P3表達(dá)量與患者腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，且SUMO1P3高表達(dá)者OS低于SUMO1P3低表達(dá)者。隨后的細(xì)胞水平分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SUMO1P3能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象[10]。EMT發(fā)生后，細(xì)胞極性喪失，與周圍細(xì)胞和基質(zhì)的接觸減少，黏附性降低，細(xì)胞遷移、運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，侵襲能力增加。因此，EMT與惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11，12]。EMT發(fā)生時(shí)不僅細(xì)胞表型發(fā)生了變化，細(xì)胞標(biāo)記物也發(fā)生了變化。其上皮細(xì)胞標(biāo)記物如E-cadherin表達(dá)降低，同時(shí)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物如N-cadherin、β-catenin、vimentin、slug和snail等表達(dá)可增加[13]。E-cadherin表達(dá)降低是EMT最顯著的特征，也是惡性腫瘤不良臨床預(yù)后及轉(zhuǎn)移的指標(biāo)[14]。N-cadherin可促使腫瘤細(xì)胞從腫瘤原位中脫離出來(lái)，并與內(nèi)皮或基質(zhì)成分黏附進(jìn)而發(fā)生EMT，是惡性腫瘤細(xì)胞具有侵襲性的表型，易于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[15，16]。本研究結(jié)果表明，沉默SUMO1P3可使PANC-1細(xì)胞中的上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)增加，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物N-cadherin和β-catenin的表達(dá)減少。這些表明SUMO1P3在PANC-1中能夠促進(jìn)EMT過(guò)程的發(fā)生。

綜上所述，SUMO1P3在胰腺癌組織中高表達(dá)，且與胰腺癌患者病情進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)，可作為胰腺癌診斷及預(yù)后檢測(cè)的新靶點(diǎn)。SUMO1P3能夠通過(guò)促進(jìn)EMT發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲。因此，抑制SUMO1P3可以作為逆轉(zhuǎn)EMT的新靶點(diǎn)，從而抑制胰腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移，為研發(fā)新的靶向EMT的治療措施、改善胰腺癌患者預(yù)后提供理論依據(jù)。

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