李慧文，張有辰，許春花，池永學，金正勇

(延邊大學附屬醫(yī)院，吉林延吉133000)

疾病即支氣管肺發(fā)育不良(BPD)，其主要病理特征包括肺水腫、肺淋巴管擴張、炎癥及隨后的肺纖維化[1]。C型鈉尿肽(CNP)為鈉尿肽家族成員之一，可選擇性地與跨膜鳥苷酸環(huán)化酶(GC)-B受體聯(lián)合，誘導細胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)含量大幅度增多[2]，可通過生成趨化因子減輕博來霉素誘導的炎癥反應；在新生大鼠CNP由心臟成纖維細胞以及血管內(nèi)皮細胞合成，起自分泌調(diào)節(jié)作用，參與抑制心肌過度纖維化及分泌炎癥細胞因子[3]。但是，CNP在高氧性肺損傷新生大鼠肺組織炎癥和肺損傷中的作用及其機制尚不清楚。2016年4月～2017年5月，我們觀察了CNP對新生大鼠高氧肺損傷的防治作用，并進一步探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 足月新生Wistar大鼠60只，體質(zhì)量6～9 g, 由延邊大學動物科提供，動物許可證號：SYXK(吉2007-0011)。CNP(Sigma公司)，IL-1β、IL-6、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，cGMP試劑盒(美國BioVision公司)。

1.2 高氧肺損傷模型制備與處理方法 將60只新生大鼠隨機分組對照組、高氧組、干預組。對照組新生大鼠被置于室外呼吸空氣，高氧組和干預組大鼠持續(xù)暴露于85%～90% O2模型箱中；干預組從第1天開始腹腔注射CNP 3 μg/(kg·d)，余兩組腹腔注射生理鹽水，均連續(xù)注射7 d。

1.3 標本獲取與指標觀察方法 ①新生鼠麻醉后，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)，離心后沉淀涂載玻片，自然干燥后行Diff-quik染色，在100倍光學纖維鏡下計數(shù)白細胞。將BALF離心取上清液，根據(jù)IL-1β、IL-6試劑盒按說明書操作進行檢測。②剪開胸腔取右肺，輕輕擦干表面，稱濕重；置于80 ℃烘干箱48 h，稱干重，計算濕/干重(W/D)評估肺水腫。③取部分左肺組織并浸泡于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋、切片、HE染色，觀察肺組織病理形態(tài)學改變。④取部分左肺組織，加入磷酸鹽緩沖液，冰浴中勻漿，10 000 r/min離心10 min后取上清液，按照SOD和MDA試劑盒說明書進行檢測。另取適量肺組織稱重，制備10倍體積(0.1 mol/L HCL)的勻漿液，Polytron-type均質(zhì)劑處理樣品，離心10 min，取上清按照試劑盒說明書檢測cGMP。

2 結(jié)果

2.1 各組肺組織病理形態(tài)學變化 對照組肺組織肺泡結(jié)構(gòu)逐漸完整、肺泡數(shù)量增加，無液體和炎癥滲出。高氧組肺組織肺泡大小不一，肺泡間隔斷裂，可見大量炎性細胞滲出，有的肺泡塌陷，肺泡出血，肺泡上皮細胞脫落。干預組肺組織形態(tài)學改變較高氧組好轉(zhuǎn)，炎癥滲出減少，肺泡結(jié)構(gòu)稍清晰，肺組織有修復。

2.2 各組肺W/D及BALF中白細胞數(shù)、細胞因子水平比較 與對照組相比，高氧組肺W/D及BALF中白細胞數(shù)、細胞因子(IL-1β、IL-6)水平均增高(P均<0.05)；與高氧組相比，干預組肺W/D及BALF中白細胞數(shù)、細胞因子水平均降低(P均<0.05)。見表1。

表1 各組肺W/D及BALF中白細胞數(shù)、細胞因子水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與高氧組比較，#P<0.05。

2.3 各組肺組織中SOD活性、MDA和cGMP表達比較 與對照組相比，高氧組肺組織中SOD活性和cGMP表達降低而MDA表達增加(P均<0.05)；與高氧組相比, 干預組肺組織中MDA表達降低而SOD活性和cGMP表達均增加(P均<0.05)。見表2。

表2 各組肺組織SOD活性、MDA和cGMP表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與高氧組比較，#P<0.05。

3 討論

產(chǎn)后氧氣吸入能改善缺血缺氧新生兒和早產(chǎn)兒的缺氧狀態(tài)，但長時間吸入高濃度氧易導致新生兒BPD。由于新生大鼠生后前2周是肺泡與肺血管發(fā)育的關鍵時期，本實驗這種短期的新生大鼠高氧模型，包含了肺泡發(fā)育的初始階段，這與新生兒出生后立即接受氧療相類似。結(jié)果顯示，干預組和模型組吸入高氧后，新生大鼠肺W/D 、BALF 中白細胞數(shù)量逐漸增加。這表明高氧可以引起肺水腫及炎性反應，從而影響肺泡及肺血管發(fā)育。

高氧暴露可上調(diào)氧自由基分泌，使細胞受損，誘導新生兒氧自由基病，包括BPD、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、腦室內(nèi)出血等。高氧暴露產(chǎn)生的體內(nèi)代謝產(chǎn)物活性氧(ROS)，參與脂質(zhì)過氧化、DNA鏈斷裂、蛋白質(zhì)變性，進而誘導引起細胞死亡。ROS增加可過度誘導細胞膜脂質(zhì)過氧化，其產(chǎn)物MDA表達也升高，因此MDA表達的變化可以反映體內(nèi)氧化損傷的程度。SOD是機體抗氧化酶，其表達變化反映體內(nèi)抗氧化狀態(tài)，可降低自由基的活性。研究[4,5]發(fā)現(xiàn)，高氧暴露可顯著增加MDA、谷胱甘肽過氧化物酶，而降低SOD活性，急性氧化應激增加肺組織中MDA表達。高氧肺損傷與大量的細胞因子和炎癥因子緊密聯(lián)系。高氧時體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)受損，出現(xiàn)氧化應激、炎癥、損傷和修復過程，其中炎癥反應涉及IL-1、IL-6以及腫瘤壞死因子α(TNF-α)等細胞因子[6,7]。研究[8]發(fā)現(xiàn)，高氧暴露30 min時大鼠肺組織IL-1β、IL-6 及TNF-α表達增加，并且肺內(nèi)有大量巨噬細胞浸潤。IL-1β是致炎細胞因子，在應激反應后各種疾病的炎癥疾病初期起主要作用。在高氧誘導的BPD中，IL-1β起重要作用，暴露于85%O2連續(xù)10 d，可增加Rac1蛋白并激活IL-1β活性[9]。

已有研究[10，11]表明，肺動脈高壓大鼠模型中，CNP抑制巨噬細胞、嗜中性粒細胞和淋巴細胞等炎性細胞浸潤；在脂多糖(LPS)誘導的急性肺損傷模型中，CNP起到抑制炎性細胞浸潤作用，CNP可降低博來霉素誘導的肺組織中IL-1β、IL-6表達[12]。以上研究表明，CNP可抑制炎癥反應，但是其對高氧性肺損傷的防護作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，CNP干預組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺組織有所修復，并降低高氧引起的肺水腫，表明CNP可減輕肺泡損傷和肺水腫；CNP組BALF中白細胞數(shù)、IL-1β及IL-6水平降低，而且肺組織中MDA表達降低、SOD活性升高，證實CNP能夠阻止高氧引起的炎癥反應和氧化應激反應。CNP與其受體結(jié)合增加細胞內(nèi)cGMP，進而發(fā)揮其生理學效應。cGMP是參與細胞功能調(diào)節(jié)的第二信使。Sopi等[13]研究表明，出生后第5天的幼鼠連續(xù)暴露于95%O2中7 d，測得肺組織cGMP表達減少，高氧暴露還可以通過NO-cGMP信號通路損壞肺實質(zhì)的松弛反應[14]。Lee等[15]研究報道，高氧暴露小鼠在高氧誘導14 d后肺泡發(fā)生纖維化,降低可溶性鳥苷酸環(huán)化酶活性及cGMP活性，破壞cGMP信號通路。本研究中高氧暴露的新生大鼠肺組織中cGMP表達明顯降低，而CNP明顯提高肺組織中cGMP表達，提示CNP可通過增加cGMP的生成減輕高氧性肺損傷。 綜上可見，CNP可防治高氧肺損傷,其機制可能為CNP提高肺組織cGMP表達和降低肺內(nèi)炎癥細胞聚集。

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