任華景，劉曉志，杜 力，高 健，王志明

0 引言

單克隆抗體由2條重鏈2條輕鏈組成，相對(duì)分子質(zhì)量高達(dá)150 kDa左右，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。目前，單克隆抗體大多是采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行生產(chǎn)，單克隆抗體在生物化學(xué)和生物物理方面是異質(zhì)的，這主要取決于復(fù)雜的翻譯后修飾和降解事件[1]，導(dǎo)致了產(chǎn)品的分子大小、電荷、糖基化修飾等不均一性及其相應(yīng)的變體產(chǎn)生[2]。采用一些電荷分離技術(shù)如等電聚焦(IEF)凝膠電泳、毛細(xì)管等電聚焦(cIEF)凝膠電泳、陽(yáng)離子交換色譜(CEX)、陰離子交換色譜(AEX)分析單抗會(huì)發(fā)現(xiàn)變體，這些變體被稱(chēng)為酸性或堿性物質(zhì)。IEF方法分析單抗，低于等電點(diǎn)(PI)的為酸性變體，高于PI的為堿性變體?；谏V法分析，酸性和堿性物質(zhì)界定是通過(guò)主峰的保留時(shí)間。CEX方法檢測(cè)酸性物質(zhì)變體峰比主要物質(zhì)峰先洗脫出來(lái)，堿性變體峰比主要物質(zhì)峰晚洗脫出來(lái)；AEX方法檢測(cè)酸性物質(zhì)變體峰比主要物質(zhì)峰晚洗脫出來(lái)，堿性變體峰比主要物質(zhì)峰早洗脫出來(lái)。

盡管有學(xué)者同意采用等點(diǎn)聚焦電泳和層析圖譜方法來(lái)計(jì)算酸性和堿性物質(zhì)的量，但由于分離機(jī)制的不同，計(jì)算這些物質(zhì)的量仍存在區(qū)別。IEF分離抗體變體是基于總電荷的不同(表觀(guān)PI)，但是，除總電荷外，在通過(guò)色譜法分離抗體變量時(shí)發(fā)現(xiàn)電荷分布也起著關(guān)鍵作用，這可能影響抗體和介質(zhì)的相互作用。IEF和離子交換(IEX)的不同已有報(bào)道[3]。如：鼠抗片段通過(guò)弱陽(yáng)離子交換柱分離出峰的保留時(shí)間不同，但是采用IEF分析顯示了相同的PI[3]。人鼠嵌合體單抗的Fab片段無(wú)論是在輕鏈上還是在重鏈上都有焦谷氨酸，所以沒(méi)有發(fā)現(xiàn)不同的PI，可以通過(guò)強(qiáng)陽(yáng)離子交換(SCX)來(lái)分析。這些例子說(shuō)明基于色譜法分離不僅僅依賴(lài)于所有的電荷分布，在不存在電荷分布不同的情況下，一樣可以達(dá)到分離的效果。不過(guò)主要的分離動(dòng)力還是來(lái)自于電荷分布的不同。

在重組單克隆抗體的生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中，往往會(huì)發(fā)生產(chǎn)品的聚集、降解及各種翻譯后修飾，從而導(dǎo)致產(chǎn)品的分子大小、電荷、糖基化修飾等不均一性及其相應(yīng)的變體產(chǎn)生[4]。電荷變體主要影響抗體體內(nèi)和體外性狀。已經(jīng)被證實(shí)抗體使用化學(xué)修飾能改變結(jié)合蛋白或細(xì)胞膜靶標(biāo)，從而影響組織穿透、組織分布和藥代動(dòng)力學(xué)(PK)[5]。變體的作用高度依賴(lài)于性質(zhì)，翻譯后修飾的位置和程度，而最終這些變體形成了酸性和堿性物質(zhì)。

本綜述主要基于色譜技術(shù)收集變體來(lái)分析描述酸性和堿性物質(zhì)[6]，酸性和堿性物質(zhì)通常由IEF和cIEF觀(guān)察到，從IEF和cIEF收集足夠的材料用于詳細(xì)描述是具有挑戰(zhàn)性的。

1 單克隆抗體的主要物質(zhì)

抗體中的主要物質(zhì)在色譜中主峰的位置洗脫。主要物質(zhì)不一定對(duì)應(yīng)于未修飾或者未降解的抗體。主峰通常是由具有3種典型的翻譯后修飾的抗體種類(lèi)組成：①N-末端谷氨酰胺(Gln)環(huán)化為pyroGlu；②去除重鏈C-末端賴(lài)氨酸(Lys)；③帶有中性寡糖的CH2結(jié)構(gòu)域中保守的天冬酰胺(Asn)殘基的糖基化。主要物質(zhì)將作為對(duì)酸性和堿性物質(zhì)詳細(xì)表征的重要控制。

1.1 N-末端Gln環(huán)化作用 N-末端Gln在輕鏈和重鏈之一或兩者的基因中編碼，其可以在合成后自發(fā)地環(huán)化形成pyroGlu。色譜法分析時(shí)發(fā)現(xiàn)大多數(shù)抗體含有N-末端pyroGlu而不是原始Gln，因此作為主峰洗脫[7-8]。

1.2 C-末端賴(lài)氨酸去除 同樣，重鏈C-末端的Lys在重鏈基因中編碼。羧肽酶處理后導(dǎo)致的不完全去除的C-末端使得抗體攜帶0、1或2個(gè)C-末端賴(lài)氨酸殘基[9]。通常在主要物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)沒(méi)有任何C-末端賴(lài)氨酸的抗體[10]。

1.3 N-連接的寡糖糖基化 在CH2結(jié)構(gòu)域中保守的Asn殘基用N-連接的寡糖糖基化，從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獲得的重組單抗主要糖型是核心巖藻糖苷復(fù)合物雙天線(xiàn)結(jié)構(gòu)，帶有0、1、2個(gè)末端半乳糖殘基。

2 單克隆抗體的酸性物質(zhì)

酸性物質(zhì)是抗體的變體，用CEX-HPLC法分析發(fā)現(xiàn)其比主峰早洗脫出來(lái)，用AEX法則比主峰晚洗脫出來(lái)。形成酸性物種的主要原因如下。

2.1 唾液酸 唾液酸一般是構(gòu)成了酸性物質(zhì)。在NS0細(xì)胞中表達(dá)的重組IgG1抗體中的酸性級(jí)分中檢測(cè)到唾液酸[8]。在CHO細(xì)胞表達(dá)的重組IgG1抗體中的酸性級(jí)分中也檢測(cè)到了高水平的唾液酸[11]。唾液酸酶處理后，用CEX-HPLC分析山羊表達(dá)的重組單克隆抗體時(shí)，發(fā)現(xiàn)酸性物質(zhì)的百分比更低，表明唾液酸的存在是這些酸性物種的主要原因[10]。采用CEX分析時(shí)，在IgG4抗體的酸性區(qū)域中也檢測(cè)到了唾液酸[12]。

2.2 天冬酰胺殘基的脫酰胺化 天冬酰胺殘基的脫酰胺化可能為酸性物質(zhì)產(chǎn)生的主要原因。脫氨發(fā)生在可變結(jié)構(gòu)域，特別是在暴露的和靈活的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)中以及在恒定結(jié)構(gòu)域中。CDR區(qū)殘基的脫酰胺化幾乎保證了酸性物質(zhì)的產(chǎn)生[13]。Asn殘基的脫酰胺在CH3的不變區(qū)域具有氨基酸序列SNGQPENNYK已被廣泛報(bào)道。盡管來(lái)自每個(gè)位點(diǎn)的特定產(chǎn)物仍然有爭(zhēng)議，但通常認(rèn)為脫酰胺化僅發(fā)生在該序列的第1和第2個(gè)Asn殘基處[14]。恒定區(qū)中Asn殘基的脫酰胺化也最可能導(dǎo)致酸性物質(zhì)的形成[15]。

2.3 其他修飾 其他修飾也可能導(dǎo)致酸性物質(zhì)的產(chǎn)生。如：通過(guò)CEX分析時(shí)，具有非經(jīng)典二硫鍵的IgG2(IgG2B和IgG2A /B)比具有經(jīng)典鍵聯(lián)(IgG2A)的分子早洗脫[16]。使用AEX分析時(shí)，首先，在重組人IgG2中鑒定的含有三硫鍵的抗體比主峰洗脫晚，因此認(rèn)為對(duì)應(yīng)的是酸性物質(zhì)[17]。研究顯示，具有高甘露醇含量的抗體變體在重組單抗的酸性部分中富集，但是在高甘露糖寡糖和具有核心巖藻糖的復(fù)合雙觸角寡糖之間沒(méi)有電荷差異，這也證明了色譜法分離不僅基于電荷差異，而且還基于微妙的構(gòu)象差異[18]。已經(jīng)用于制劑以防止由曝光引起氧化的硫代硫酸鹽可以與抗體反應(yīng)以形成酸性物質(zhì)[19]。糖基化、還原糖和Lys殘基的側(cè)鏈或N-末端伯胺之間的反應(yīng)由于中和了正電荷，導(dǎo)致酸性物質(zhì)的產(chǎn)生[20]。

3 酸性物質(zhì)對(duì)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能的影響

由于導(dǎo)致產(chǎn)生酸性物質(zhì)的各種修飾對(duì)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能的潛在影響高度依賴(lài)于其位置。由于柔性鉸鏈區(qū)，位于Fc區(qū)中的修飾可能對(duì)Fab片段沒(méi)有顯著影響。如：唾液酸的存在不影響抗體效力[7]，但是對(duì)抗原結(jié)合和效力具有實(shí)質(zhì)性影響。CDR區(qū)中的脫氨基化導(dǎo)致抗原結(jié)合親和力和重組單克隆抗體的效力降低[6]。糖基化增加聚集體的形成而不改變抗體構(gòu)象[21]，表明由Lys的糖基化引起的表面正電荷降低可能導(dǎo)致抗體分子之間的較低排斥。另外，具有半胱氨?；磻?yīng)的抗體顯示出降低的熱穩(wěn)定性，更容易形成聚集體。

4 單克隆抗體的堿性物質(zhì)

堿性物質(zhì)在CEX-HPLC分析中比主要物質(zhì)峰晚洗脫出來(lái)，而在A(yíng)EX-HPLC分析中早于主要物質(zhì)峰洗脫出來(lái)的物質(zhì)。形成堿性物質(zhì)的一個(gè)主要原因歸納如下。

4.1 C末端Lys不完全去除 形成堿性物質(zhì)的一個(gè)主要原因是不完全去除C末端Lys。具有重鏈C末端Lys的單抗，由于額外的正電荷，而比主要物質(zhì)更偏堿性[22]。由于羧肽酶B(CPB)能夠特異性地去除C-末端堿性氨基酸殘基，因此比較CPB消化前后抗體的色譜圖，可以清楚地證明C末端Lys對(duì)堿性物質(zhì)形成的貢獻(xiàn)。

4.2 N末端Gln與輕鏈或重鏈或兩者的pyroGlu的不完全環(huán)化 堿性物質(zhì)形成的另一種常見(jiàn)的修飾是N末端Gln與輕鏈或重鏈或兩者pyroGlu的不完全環(huán)化。Gln最初編碼在基因中，但其可以經(jīng)歷自發(fā)反應(yīng)以產(chǎn)生pyroGlu。具有原始Gln抗體的表觀(guān)pI高于主要物質(zhì)，因此被稱(chēng)為堿性物質(zhì)[23]。

4.3 脫酰胺化 與脫酰胺相似，異構(gòu)化頻繁發(fā)生在CDR區(qū)域，很少在恒定區(qū)域發(fā)生[24]。經(jīng)CEX分析后，重鏈CDR3中的帶有isoAsp 102的重鏈單克隆抗體比帶有原始Asp的抗體晚洗脫出來(lái)[25]。作為Asn脫酰胺和Asp異構(gòu)化的常見(jiàn)中間體的琥珀酰亞胺也可以有助于產(chǎn)生堿性物質(zhì)[18]。

4.4 其他修飾 幾種其他修飾可以產(chǎn)生堿性物種。通過(guò)CEX-HPLC分析時(shí)，抗體Fc區(qū)中兩個(gè)保守的甲硫氨酸(Met)殘基的氧化在堿性區(qū)域得到洗脫[26]。在重組單抗的CDR2區(qū)域中的Met殘基的氧化還導(dǎo)致堿性物質(zhì)的產(chǎn)生[26]。去除重鏈C-末端Lys后脯氨酸殘基的酰胺化導(dǎo)致堿性物質(zhì)的形成[27]。在輕鏈或重鏈的Fc區(qū)，具有從絲氨酸到精氨酸的單個(gè)氨基酸突變的重組單抗作為堿性物質(zhì)從CEX柱洗脫[28]。具有一個(gè)糖基化重鏈和一個(gè)具有短寡糖的重鏈的抗體也作為堿性物質(zhì)從CEX柱洗脫[29]。

5 堿性物質(zhì)對(duì)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能的影響

抗體的N-末端或C-末端的修飾對(duì)抗體結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能具有實(shí)質(zhì)性影響，因?yàn)檫@些區(qū)域是高度暴露的，并且不是任何配體結(jié)合位點(diǎn)的一部分。研究已證明琥珀酰亞胺形成對(duì)抗原結(jié)合親和力和效力的影響，在重鏈CDR2中含有琥珀酰亞胺的Fab片段結(jié)合親和力降低，與具有原始Asn的抗體相比，具有琥珀酰亞胺的抗體顯示出的效力有所降低[26]。

Fc區(qū)域中甲硫氨酸殘基的氧化不影響重組單抗的抗原結(jié)合與效力；然而，其確實(shí)引起主要在CH2結(jié)構(gòu)域中的構(gòu)象變化，導(dǎo)致熱穩(wěn)定性降低和聚集傾向增加[30]。熱穩(wěn)定性降低通過(guò)差示掃描量熱法(DSC)測(cè)量重鏈CDR2區(qū)域Met殘留的氧化得到證實(shí)[31]。

6 結(jié)論

制備出重組單抗樣品時(shí)，通常能觀(guān)察到酸性和堿性物質(zhì)。完全消除酸性和堿性物質(zhì)是不現(xiàn)實(shí)的和不必要的。對(duì)于與特異性宿主表達(dá)系統(tǒng)相關(guān)的重組單抗，一些蛋白修飾是特有的(如：通過(guò)山羊乳中的馬來(lái)酸修飾)，還有一些蛋白修飾是在蛋白生產(chǎn)和配制過(guò)程中發(fā)生的(如：硫代硫酸鹽修飾)。其對(duì)生物功能的影響高度依賴(lài)于位點(diǎn)和修飾水平。對(duì)于局限于Fc區(qū)的修飾，即使存在較高水平也不會(huì)對(duì)結(jié)合親和力有直接影響。類(lèi)似地，局限于Fab區(qū)的修飾可能不影響Fc相關(guān)功能，如：受體結(jié)合。修改的水平對(duì)于效果有很大的影響。如：Asn55的脫酰胺度較低在重鏈CDR區(qū)域不影響一種抗體的效力[7]，但是一條重鏈中的isoAsp55或Asp55可將另一種抗體的效力降低[26]。脫酰胺對(duì)2種抗體影響的區(qū)別可能是由于與其相互作用的抗原不同，此外，脫酰胺占百分比也起了重要作用。通過(guò)色譜法分析已鑒定出導(dǎo)致酸性和堿性電荷變體的修飾，但解酸性和堿性變體的性質(zhì)仍不明確。因此，在單克隆抗體研發(fā)和制備的過(guò)程中，必須要評(píng)估酸性或堿性變體對(duì)主要物質(zhì)的穩(wěn)定性和功能的影響。修飾可能是關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA)或關(guān)鍵過(guò)程屬性(KPA)。因此，為了確保治療性重組單克隆抗體的有效性和安全性，分析酸性和堿性物質(zhì)的產(chǎn)生至關(guān)重要。

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