劉徐妹，陳彥

(1南方醫(yī)科大學(xué)，廣州510515；2南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院)

組織工程是指將種子細(xì)胞接種至可降解的支架材料上，通過支架中細(xì)胞的增殖、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)分泌以及支架材料自身的逐漸降解，最終在體外或體內(nèi)構(gòu)建組織或器官替代物的技術(shù)。支架材料是組織工程三大要素之一，而動(dòng)態(tài)分析支架特性始終是組織工程領(lǐng)域亟待解決的難題之一。因此，研發(fā)一種可動(dòng)態(tài)分析支架特性的簡便、無創(chuàng)性檢測(cè)技術(shù)至關(guān)重要。傳統(tǒng)檢測(cè)方法，如標(biāo)本組織學(xué)切片染色法、直接機(jī)械測(cè)量法和重量法等，大多需以犧牲動(dòng)物為代價(jià)，無法進(jìn)行連續(xù)性評(píng)估，也無法直接應(yīng)用于人體或培養(yǎng)條件下的支架材料。近年來，多模態(tài)超聲成像技術(shù)為支架材料特性分析提供了新思路，并以其便捷、無輻射、無創(chuàng)、實(shí)時(shí)等特點(diǎn)在組織工程領(lǐng)域表現(xiàn)出較高的應(yīng)用價(jià)值。本文將多模態(tài)超聲成像技術(shù)在評(píng)估支架特性方面的研究進(jìn)展進(jìn)行系統(tǒng)回顧，以期促進(jìn)超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)的發(fā)展和加速其臨床轉(zhuǎn)化。

1 多模態(tài)超聲成像技術(shù)及其評(píng)估支架特性的基本原理

多模態(tài)超聲成像技術(shù)可用于無創(chuàng)評(píng)估支架材料特性，評(píng)估相關(guān)技術(shù)主要包括灰階超聲、超聲背向散射技術(shù)(BUS)和超聲彈性成像(UEI)等，它們的原理及評(píng)估方法不盡相同，可互為補(bǔ)充。

灰階超聲利用超聲波在材料或組織中傳播時(shí)反射的回波信號(hào)進(jìn)行成像，回波強(qiáng)度以灰階(亮度)形式顯示。當(dāng)支架特性變化時(shí)，支架內(nèi)部聲阻抗差會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)變化，從而圖像灰階值大小也會(huì)隨之變化，因此通過圖像灰階值變化可間接反映支架特性變化。

BUS是一種可定量分析組織微結(jié)構(gòu)特征的方法，原理基于灰階超聲，但在射頻信號(hào)處理前，通過特制時(shí)間門控電路提取感興趣區(qū)域的原始射頻信號(hào)進(jìn)行定量分析，從而獲取多種聲學(xué)參數(shù)，如背向散射積分(IBC)、斜率(slope)和中頻帶擬合(MBF)等。這些參數(shù)與組織或材料微結(jié)構(gòu)大小、密度及組成等密切相關(guān)，因此BUS可以用于定量表征組織的微結(jié)構(gòu)特征。

UEI的基本原理是對(duì)組織施加一個(gè)靜態(tài)或動(dòng)態(tài)激勵(lì)，在彈性力學(xué)、生物力學(xué)等物理規(guī)律的作用下，組織會(huì)產(chǎn)生一個(gè)響應(yīng)，如應(yīng)變、位移、速度等分布產(chǎn)生一定改變，再利用超聲成像方法和數(shù)字信號(hào)處理技術(shù)估測(cè)出組織內(nèi)部的響應(yīng)程度，從而間接或直接反映組織內(nèi)部彈性模量等力學(xué)特性的差異。歐洲超聲協(xié)會(huì)聯(lián)盟2017年最新發(fā)布的分類指南[1]將UEI分為應(yīng)變彈性成像(SE)、聲輻射力脈沖(ARFI)成像和剪切波彈性成像(SWE)三類。而ARFI成像和SWE均以聲輻射力作為激勵(lì)方式，也稱為聲輻射力彈性成像技術(shù)。目前用于支架特性評(píng)價(jià)的UEI技術(shù)包括SE、傳統(tǒng)ARFI成像、雙模態(tài)UEI (DUE)[2]、單點(diǎn)式SWE(pSWE)[1]和超高速SWE(SSI)[1]。

2 多模態(tài)超聲成像技術(shù)對(duì)支架特性的監(jiān)測(cè)分析

2.1 灰階超聲動(dòng)態(tài)分析支架材料的結(jié)構(gòu)和組成特征 灰階超聲為支架材料的可視化提供了一種簡便、實(shí)時(shí)、無創(chuàng)的手段。Solorio等[3]利用診斷性超聲(12 MHz)實(shí)時(shí)、直觀地呈現(xiàn)了聚乳酸-羥基乙酸原位凝膠遞藥系統(tǒng)(ISFI)的液-固相變過程，使持續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)ISFI的形成過程成為可能。該技術(shù)不僅可長時(shí)間動(dòng)態(tài)分析植入物體積的變化情況，還可動(dòng)態(tài)評(píng)估其外溢或纖維包裹情況，為體內(nèi)、外監(jiān)測(cè)ISFI的形成過程和其內(nèi)藥物的釋放速率提供了重要信息。研究表明[4, 5]，診斷性超聲也是一種可實(shí)時(shí)、原位、定量分析支架材料組織再生的新型手段，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法有創(chuàng)、耗時(shí)長、不可重復(fù)等不足。支架中ECM的沉積量是其組織再生的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。Kreitz等[5]定量監(jiān)測(cè)了一種肌纖維母細(xì)胞-纖維蛋白凝膠支架(培養(yǎng)條件下)的灰階值大小，并分析了其與支架中ECM沉積量之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其灰階值與ECM含量之間呈強(qiáng)線性關(guān)系，說明診斷性超聲可用于定量評(píng)估支架材料組織再生情況，且具有較高的評(píng)估效能。Chen等[6, 7]通過診斷性超聲(12 MHz)介導(dǎo)可注射性殼聚糖支架或接枝的殼聚糖/納米羥基磷灰石/膠原(CS/nHAC)復(fù)合支架的注入和監(jiān)測(cè)此類成骨支架材料的體內(nèi)過程，研究表明診斷性超聲不僅可以直觀、安全、準(zhǔn)確地介導(dǎo)骨支架材料的注入，還能無創(chuàng)性監(jiān)測(cè)可注射性骨支架材料的固化過程和支架在體內(nèi)的降解、骨再生等情況。Chen等[8]還發(fā)現(xiàn)診斷性超聲對(duì)可注射成骨支架材料體內(nèi)成骨能力和降解速率的評(píng)估效能與CT相當(dāng)。高頻超聲(>20 MHz)可明顯提高圖像空間分辨率，已用于體外表征支架材料特性，可對(duì)水凝膠支架進(jìn)行立體成像，直觀地呈現(xiàn)了其內(nèi)細(xì)胞或微粒的濃度差異和空間分布情況[9,10]。

灰階超聲具有便捷、經(jīng)濟(jì)、實(shí)時(shí)、無創(chuàng)、安全等優(yōu)點(diǎn)，在表征支架的結(jié)構(gòu)和組成特征中表現(xiàn)出較大的應(yīng)用價(jià)值，其應(yīng)用有助于加速組織工程與再生醫(yī)學(xué)技術(shù)和產(chǎn)品的臨床轉(zhuǎn)化，但也存在一定局限性，如易受系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置和操作者經(jīng)驗(yàn)的影響、僅提供宏觀信息等。

2.2 BUS定量評(píng)估支架材料的微結(jié)構(gòu) 近年來，BUS已證實(shí)可用于定量分析支架中細(xì)胞、膠原纖維、礦化物質(zhì)等微結(jié)構(gòu)，且其獲取的聲學(xué)參數(shù)(如IBC、slope、MBF等)與超聲系統(tǒng)設(shè)置、換能器特性無關(guān)，可提供有價(jià)值的量化評(píng)估指標(biāo)。通過獲取IBC值，BUS可估算支架中細(xì)胞濃度和膠原蛋白含量，且能應(yīng)用于培養(yǎng)條件下的支架材料，擴(kuò)寬了傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用范圍，為快速檢測(cè)支架中的細(xì)胞濃度和膠原含量提供了一種無創(chuàng)性方法。Mercado等[11]研究發(fā)現(xiàn)，瓊脂糖凝膠支架的IBC值大小與其細(xì)胞濃度呈線性關(guān)系，證實(shí)IBC值可作為估算支架中細(xì)胞濃度的量化指標(biāo)。Mercado等[9]還發(fā)現(xiàn)IBC值大小與支架材料中膠原蛋白含量同樣具有線性關(guān)系，表明IBC值也用于估算支架膠原蛋白含量，并能提供膠原微結(jié)構(gòu)的空間分布信息，為組織工程研究提供重要的功能信息。除了獲取IBC值，BUS還可以通過射頻信號(hào)分析技術(shù)獲取slope和MBF等聲學(xué)參數(shù)，而這些參數(shù)與工程組織和支架材料中微結(jié)構(gòu)(如細(xì)胞和礦化物質(zhì))的尺寸、濃度和聲阻抗等相關(guān)，因此也可作為該技術(shù)重要的量化指標(biāo)。目前，slope和MBF兩種聲學(xué)參數(shù)已用于體外動(dòng)態(tài)分析成骨支架材料的成骨作用和成骨細(xì)胞的分化程度。Mercado等[9]通過分析slope和MBF兩種參數(shù)來動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)三維膠原蛋白支架的礦化過程，發(fā)現(xiàn)MBF和slope分別與礦化物質(zhì)含量和顆粒大小密切相關(guān)。MBF可作為礦化物質(zhì)含量的量化指標(biāo)，而slope則是反映顆粒大小的敏感指標(biāo)。

BUS具有定量分析支架微結(jié)構(gòu)特性的能力，通過分析細(xì)胞、膠原蛋白和礦化物等多種微結(jié)構(gòu)的粒徑大小、含量和空間分布等情況來反映支架的功能狀態(tài)，為組織工程研究提供重要的功能信息。雖然BUS不受系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置的影響，彌補(bǔ)了灰階超聲的不足，但目前該技術(shù)只能應(yīng)用于體外監(jiān)測(cè)，并且數(shù)據(jù)處理過程較復(fù)雜，標(biāo)準(zhǔn)化的聲學(xué)參數(shù)指標(biāo)尚未擬定，仍有待進(jìn)一步發(fā)展。

2.3 UEI動(dòng)態(tài)分析支架材料的力學(xué)特性 UEI技術(shù)可采用體外評(píng)估和體內(nèi)無創(chuàng)性監(jiān)測(cè)兩種方式動(dòng)態(tài)分析支架的力學(xué)性能，通過獲得具有較高空間分辨率的二維彈性圖像，監(jiān)測(cè)材料的硬度變化。目前主要應(yīng)用于評(píng)價(jià)組織工程骨、軟骨、血管、角膜和黏膜等支架材料的研究。

SE技術(shù)在評(píng)價(jià)支架力學(xué)性能中的應(yīng)用最為廣泛。SE技術(shù)可檢測(cè)的硬度范圍為47 kPa～4 MPa，能夠用于檢測(cè)超過軟組織硬度的組織或材料，如支架材料、遞藥系統(tǒng)等[12]。該技術(shù)可通過動(dòng)態(tài)分析支架的力學(xué)性能變化來監(jiān)測(cè)其降解和組織再生情況。Kim等[13]發(fā)現(xiàn)聚檸檬酸-1,8-辛二醇酯可降解支架的平均應(yīng)變值隨支架的降解而明顯增大，而應(yīng)變值的變化曲線與機(jī)械測(cè)量獲取的彈性模量變化曲線高度擬合，證明了SE技術(shù)監(jiān)測(cè)支架降解的可行性。Zhou等[14]利用SE技術(shù)成功監(jiān)測(cè)了ISFI的腐蝕進(jìn)程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)材料的平均應(yīng)變值和侵蝕值之間存在的強(qiáng)線性關(guān)系。支架的力學(xué)特性不僅受降解的影響，還會(huì)受組織再生的影響，因此通過UEI技術(shù)測(cè)得的彈性模量變化通常是其降解和組織再生的綜合結(jié)果。Yu等[15]建立大鼠腹壁修復(fù)模型和采用SE技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)3種多孔高分子支架材料的力學(xué)性能變化，證實(shí)了該技術(shù)可用于監(jiān)測(cè)支架材料的體內(nèi)重塑過程。Chen等[16]發(fā)現(xiàn)實(shí)時(shí)彈性成像也可用于記錄可注射CS/nHAC成骨支架材料的體內(nèi)過程，通過獲取對(duì)照區(qū)和材料區(qū)的應(yīng)變比值可以半定量分析支架的力學(xué)特性變化，進(jìn)而評(píng)估支架體內(nèi)成骨過程,其應(yīng)變結(jié)果與microCT結(jié)果相吻合。SE技術(shù)由于其簡便、實(shí)時(shí)、經(jīng)濟(jì)、安全等特點(diǎn)仍具有較高的應(yīng)用價(jià)值，但存在一定局限性，如易受主觀經(jīng)驗(yàn)影響、缺乏客觀定量指標(biāo)、應(yīng)用范圍限于淺表組織等。

ARFI成像技術(shù)已用于評(píng)估支架材料的黏彈特性。支架材料是黏彈性物質(zhì)，其彈性和黏性對(duì)其功能化均具有重要意義，但是目前絕大多數(shù)研究只表征其彈性屬性，而忽略了其黏性屬性。黏彈性物質(zhì)可視為彈性體和液體的混合物，當(dāng)其發(fā)生應(yīng)變的時(shí)候，其彈性部分承擔(dān)靜態(tài)應(yīng)力，而液體部分不承擔(dān)靜態(tài)應(yīng)力。由于液體具有黏滯性，黏彈性物質(zhì)在應(yīng)力作用和撤銷時(shí)的應(yīng)變都有不同程度的滯后。因此，ARFI成像技術(shù)利用超聲波向支架局部施加輻射壓力 ,使支架會(huì)產(chǎn)生一定應(yīng)變，瞬時(shí)終止聲輻射力，讓支架恢復(fù)至響應(yīng)前的狀態(tài)，通過檢測(cè)支架應(yīng)變-恢復(fù)過程中不同時(shí)間的應(yīng)變程度，即可反映組織的黏彈特性。早期的ARFI成像技術(shù)是利用單一的超聲系統(tǒng)進(jìn)行成像，無法同時(shí)兼顧聲輻射力大小和圖像空間分辨率，應(yīng)用受限。DUE技術(shù)[2]通過將激勵(lì)系統(tǒng)和成像系統(tǒng)分開進(jìn)行成像，完好地解決了早期ARFI成像技術(shù)存在的問題。該技術(shù)既能滿足所需聲輻射力的要求，又能描繪出高分辨率的黏彈性圖像，其空間分辨率可達(dá)亞毫米級(jí)別，使支架微觀特性評(píng)估成為可能。Hong等[17]證實(shí)DUE技術(shù)用于評(píng)估水凝膠支架材料黏彈特性的可行性，直觀地呈現(xiàn)了支架整體或不同深度層面的黏彈性情況。DUE技術(shù)是采用高頻聚焦超聲進(jìn)行組織激勵(lì)，在成像過程中會(huì)產(chǎn)生一定的熱量，這些熱量可能會(huì)對(duì)支架的生長產(chǎn)生影響。DUE技術(shù)在支架微觀力學(xué)特性評(píng)估中表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛能，但其有效性和安全性仍需進(jìn)一步探究。

SWE技術(shù)在動(dòng)態(tài)分析培養(yǎng)條件下或深部組織內(nèi)支架的力學(xué)特性中表現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)是通過檢測(cè)聲輻射力所激發(fā)的剪切波進(jìn)行成像，無需依賴外力施壓，可對(duì)組織彈性進(jìn)行客觀、定量評(píng)估，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)SE技術(shù)的不足。早期的pSWE技術(shù)是利用不同角度的聲束聚焦到目標(biāo)組織來激發(fā)剪切波的產(chǎn)生，再通過檢測(cè)激發(fā)點(diǎn)旁剪切波傳播的平均速度來評(píng)估組織硬度，但該技術(shù)在評(píng)價(jià)培養(yǎng)條件下支架時(shí)會(huì)因液-固交界區(qū)域產(chǎn)生的Scholte表面波的混淆而低估剪切波速度，且其所需的聲能較大，每次聚焦后均需待探頭晶片冷卻后才能進(jìn)行下次聚焦，無法進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)量，耗時(shí)較長，應(yīng)用受限。目前最新應(yīng)用的2D-SWE該技術(shù)(即SSI技術(shù))是利用超高速超聲掃描儀產(chǎn)生平面剪切波源并追蹤其在組織內(nèi)的傳播，進(jìn)而獲取實(shí)時(shí)、量化的二維彈性圖像，可實(shí)時(shí)直觀顯示支架的軟硬程度和定量檢測(cè)支架的彈性模量值[18]。Nguyen等[19]將該技術(shù)應(yīng)用于測(cè)定離體或活體角膜的彈性和各向異性，發(fā)現(xiàn)角膜的最大硬度區(qū)域均與預(yù)期的膠原纖維區(qū)域相一致，表明SSI技術(shù)可對(duì)離體或活體角膜進(jìn)行量化評(píng)估。Park等[20]首次應(yīng)用SSI技術(shù)對(duì)活鼠體內(nèi)支架的硬度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)剪切模量結(jié)果與利用直接機(jī)械測(cè)量獲取的楊氏模量結(jié)果高度一致，表明SSI技術(shù)對(duì)活體內(nèi)支架的硬度評(píng)估效果好，并能獲取實(shí)時(shí)、量化的支架彈性圖像，為組織工程的研發(fā)提供客觀、定量的力學(xué)特性信息。但目前該技術(shù)在組織工程的應(yīng)用中仍處于初級(jí)階段，支架材料不均質(zhì)性、各向異性和黏彈性等的評(píng)估是研究的難點(diǎn)，有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，多模態(tài)超聲技術(shù)在動(dòng)態(tài)分析支架特性中表現(xiàn)出較高的應(yīng)用價(jià)值，可實(shí)時(shí)、原位分析支架材料的結(jié)構(gòu)、組成和力學(xué)性能等，為組織工程的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和術(shù)后監(jiān)測(cè)提供重要信息。不同超聲成像技術(shù)各具特點(diǎn)，相輔相成?；译A超聲在動(dòng)態(tài)分析支架結(jié)構(gòu)和組成特點(diǎn)中的應(yīng)用價(jià)值明確，雖然其存在一定局限性，但是未來仍有望在支架材料的前臨床實(shí)驗(yàn)和臨床評(píng)估中發(fā)揮重要作用。BUS在定量分析支架微結(jié)構(gòu)特性中表現(xiàn)出較大的應(yīng)用價(jià)值，將來有望成為功能化組織工程的重要評(píng)估手段，但是目前仍無法應(yīng)用于臨床，有待進(jìn)一步發(fā)展。UEI在動(dòng)態(tài)分析支架材料的力學(xué)性能中表現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，其研究重點(diǎn)已從SE轉(zhuǎn)向聲輻射力彈性成像技術(shù)，尤其是SWE技術(shù)。迄今為止，三維UEI尚未應(yīng)用于支架特性的評(píng)價(jià)，相信未來該技術(shù)在組織工程領(lǐng)域也將發(fā)揮無可替代的作用。超聲成像技術(shù)有望成為一種無創(chuàng)性組織工程“探針”，不僅可以原位分析支架材料特性而不影響其性質(zhì)和微環(huán)境，還能長時(shí)間實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)支架特性變化。

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