王若帆，孫立眾，張立鑫，楊發(fā)才，謝夢憶，李敬東

(1川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院，四川南充637000；2川北醫(yī)學院；3川北醫(yī)學院肝膽胰腸疾病研究所)

原發(fā)性肝癌(PLC)是以肝臟為原發(fā)灶的惡性腫瘤，它包括多種亞型，其中，成人以肝細胞癌(HCC)和膽管癌最為常見，兒童則以肝母細胞瘤多見[1]。HCC是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，也是全球第二大因癌癥導致死亡的原因。Bertuccio等[2]通過對世界范圍內(nèi)多個國家世衛(wèi)組織1990～2014年死于HCC患者的數(shù)據(jù)庫進行分析發(fā)現(xiàn)，許多國家HCC病死率近年有所上升，因此，研究HCC相關的發(fā)生發(fā)展機制將為該腫瘤的治療及預后提供臨床參考。在我國，HCC的病因以乙型肝炎病毒引起的慢性肝損傷為主，其他因素如丙型肝炎病毒感染、乙醇濫用、含黃曲霉毒素食物攝入、非乙醇性脂肪肝損傷[3]。當前HCC的治療手段主要有肝切除術(shù)、肝移植術(shù)、介入治療、生物治療、中醫(yī)中藥治療、放療、化療等[4]。早期發(fā)現(xiàn)早期治療HCC最為有效[5]。近年來對肝癌分子水平上的相關研究越來越多，多項研究從多個角度證明肝癌的發(fā)生是個十分復雜的過程，目前來說肝癌的發(fā)病機制還未完全解密。本文將著重從HCC的發(fā)病原因及機制兩個方面對其基礎研究的主要進展作一綜述。

1 病因

1.1 肝炎病毒感染 乙肝病毒是全球范圍內(nèi)導致HCC的最常見原因，該病毒經(jīng)由母嬰途徑、性途徑、帶病蚊蟲叮咬等方式傳播?；颊叨酁槌錾鷷r即感染該病毒，其中超過90%轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿腥荆粌H有5%～10%的乙肝患者是在成年后獲得感染而成為攜帶者的，而在這其中30%以上的人會發(fā)展成為慢性肝病，并依次經(jīng)由肝炎、肝纖維化、肝硬化、最后發(fā)展成為肝癌[6]。有研究表明感染乙肝病毒伴丙肝病毒或者丁肝病毒的人，HCC風險性會增加。高乙型肝炎病毒抗原(HBeAg)和高乙型肝炎病毒(HBV)-DNA水平表明HBV復制水平較高，此時HCC風險性亦會增加。另外，一項來自亞洲的研究提出，感染乙肝病毒C基因型的人與B基因型相比有更嚴重的肝臟疾病[7]。目前，早期接種乙肝疫苗已成為預防乙肝病毒感染最有效的措施，同時也是預防HCC、降低成人死亡率最簡單有效的方法。通過抗病毒治療病毒性肝炎患者、安全的輸血及注射同樣也可預防HCC的發(fā)生[8]。

1.2 過度飲酒 乙醇代謝使得肝細胞產(chǎn)生活性氧(ROS)，氧化應激增加。成人適度飲酒可能對健康有一定益處，如降低冠心病、Ⅱ型糖尿病的發(fā)病風險。長期飲酒導致肝臟疾病，其疾病進展速度及嚴重程度根據(jù)飲酒量的相對水平不同在個體之間可出現(xiàn)明顯的差異，這種變異可歸因于乙醇代謝酶(醇脫氫酶、醛脫氫酶)的活性以及在不同個體的表達量有差異，除此之外也受乙醇攝入方式、個體營養(yǎng)狀況、性別、吸煙或濫用其他藥物與否、肥胖、HBV或丙型肝炎病毒(HCV)感染等的影響[9]。Wang等[10]的研究表明在對于非酒精性脂肪肝炎病人即使適度飲酒也會加重肝臟炎癥及細胞凋亡；而對于大多數(shù)長期過度飲酒的人，其肝臟會經(jīng)歷脂肪變性、脂肪性肝炎、肝纖維化，但只有10%的人會發(fā)展成為肝硬化，而在肝硬化病人中只有1%～2%的人才會最終進展為HCC[11]。不可忽視過度飲酒這一病因?qū)е碌母伟┧鶐淼某林厣鐣摀?，嚴格控制飲酒量以及提高居民對乙醇和HCC聯(lián)系的意識可能對于預防居民過度飲酒引起的HCC具有一定意義。

1.3 黃曲霉毒素中毒 黃曲霉毒素是有黃曲霉和寄生曲霉的代謝產(chǎn)物，易污染水稻、玉米、牛奶等食物。它分為多種類型，其中以黃曲霉毒素B1(AFB1)最為常見，它可能導致多種癌癥，如肺癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等，其中AFB1導致HCC是毋庸置疑的，其毒性和致癌性也最強。食用被AFB1所污染的食物可以降低細胞介導的免疫，同時誘導炎癥反應導致肝實質(zhì)細胞壞死、肝內(nèi)膽管損傷、肝臟出血。慢性HBV攜帶者暴露在AFB1中可能以劑量反應方式增加其患肝硬化和HCC的風險[12]。另外，最近有動物研究揭示了妊娠可能是母體健康的一個關鍵的敏感性窗口，此時改變了AFB1的代謝并增加小鼠肝臟的DNA損傷，使之可能更易患HCC[13]。AFB1參與肝癌的發(fā)病主要是通過影響細胞色素P450的多態(tài)變異體中的CYP3A4酶，從而產(chǎn)生具有基因毒性的2，3-環(huán)氧化物代謝產(chǎn)物[14]。另外Qin等[15]利用AFB1誘導大鼠產(chǎn)生HCC模型，檢測到HCC ROS水平明顯上升，抗氧化酶活性降低。同時，促炎細胞因子、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素(IL)-1α等表達水平顯著升高，所以HCC的進展可能與炎癥反應密切相關。

1.4 非酒精性脂肪肝病(NAFLD) NAFLD是指除外乙醇、甲亢、藥物等因素引起肝細胞內(nèi)脂肪過度沉積所致的代謝綜合征，其危險因素主要有中心性肥胖、2型糖尿病、血脂異常、胰島素抵抗、香煙等，研究表明NAFLD是患HCC的一易感因素[16]，其機制在于：衰老相關分泌表型(SASP)與肥胖相關HCC的發(fā)展有著至關重要的作用。飲食或遺傳性肥胖改變腸道菌群，腸道細菌可以將膽酸代謝成為脫氧膽酸(DCA)，DCA使肝星狀細胞(HSC)產(chǎn)生SASP，導致HSC分泌各種炎癥和腫瘤促進因子從而造成細胞DNA損傷，進而可引發(fā)肝細胞癌變。阻斷肥胖小鼠腸道脫氧膽酸的合成或減少腸道細菌的數(shù)量可有效抑制HCC的發(fā)生[3]；另外，Ma等[17]發(fā)現(xiàn)了免疫反應在NAFLD導致的HCC中所扮演的重要角色，他們通過老鼠建模以及收集人類標本來進行相關檢測，實驗結(jié)果顯示NAFLD脂代謝失代償會選擇性導致肝內(nèi)CD4+淋巴細胞減少(而非CD8+淋巴細胞)，從而加速肝細胞癌變。另外CD4+淋巴細胞比CD8+淋巴細胞擁有更大的線粒體質(zhì)量以及更高的ROS水平；通過長期積累在肝細胞中的亞油酸破壞線粒體功能導致比游離脂肪酸更多的氧化傷害。阻斷ROS可以逆轉(zhuǎn)CD4+淋巴細胞減少，延遲NAFLD對HCC的促進作用。這一研究為今后治療NAFLD所致的HCC提供了新治療思路。

2 發(fā)病機制

癌基因廣泛存在于生物體中，通常情況下癌基因不表達，在一定誘因下，癌基因會發(fā)生活化、掌控細胞。Bishop等在20世紀70年代后期首次發(fā)現(xiàn)了c-myc基因后，越來越多的癌癥相關基因被發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)代觀點認為，癌癥是一種涉及基因組動態(tài)變化的疾病，包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活，如ras原癌基因的激活和p53抑癌基因的失活[18]。作為人體最易突變癌基因之一的ras基因，廣泛參與15%～20%的人類腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。研究表明，活化的ras蛋白會激活ras相關下游信號通路[19]，此時細胞增殖失去控制，不斷地進行分裂繁殖，于是就發(fā)生了腫瘤。此外，影響腫瘤發(fā)病的另一機制自噬，它是抑制腫瘤發(fā)生的關鍵過程之一，通過協(xié)調(diào)炎癥和免疫來抑制癌癥的發(fā)展[20]。近年來對肝癌分子水平上的相關研究越來越多，多項研究從多個角度證明肝癌的發(fā)生是個十分復雜的過程，目前來說肝癌的發(fā)病機制還未完全解密。下面從肝癌相關基因、單核苷酸多態(tài)性、全基因組分析、MicroRNAs(miRNAs)四個方面分別介紹近年來廣大科研人員對肝癌機制的研究所取得的進展。

2.1 HCC的相關基因

2.1.1 TP53與HCC TP53屬于最早發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，在與肝癌發(fā)生相關的體細胞突變譜中，TP53和CTNNB1的突變在亞洲國家、西方國家最為常見。研究表明此兩種基因是以共同排斥的方式發(fā)生突變。但最近Friemel等[21]首次對這一觀點提出了挑戰(zhàn)，在HCV感染相關肝癌中出現(xiàn)了TP53和CTNNB1的雙突變，這一結(jié)果目前還未得到廣泛認可。Guichard等[22]通過對125例HCC進行高分辨率拷貝數(shù)分析以及對其中24例全外顯子組序列測序，發(fā)現(xiàn)新的頻繁突變基因IRF2，相關功能分析顯示IRF2具有腫瘤抑制物特性，其滅活僅在HBV相關腫瘤中，導致TP53功能受損。對于TP53缺陷型的HCC，He等[23]構(gòu)建了能夠編碼反式剪切分子的質(zhì)粒(該質(zhì)粒可以靶向作用于TP53基因的內(nèi)含子6)，之后將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到攜帶存在TP53突變的HCC細胞中，發(fā)現(xiàn)其可以減少突變TP53基因的轉(zhuǎn)錄并且可以產(chǎn)生功能性wt-p53蛋白，這使得HCC細胞的表型發(fā)生了校正。同時，在由Tp53突變的HCC細胞建立的腫瘤異種移植物中，編碼TP53-PTM的腺病毒誘導細胞周期停滯和凋亡，然后阻斷了小鼠腫瘤的生長。該實驗首次論證了反式剪切在校正TP53缺陷型HCC細胞和異種移植物功能的作用，提供了用反式剪切修復TP53缺陷型癌癥的可行性。

2.1.2 PTEN與HCC PTEN是繼TP53后癌癥中第二位最頻繁突變的腫瘤抑制基因[24]，目前已被證實與HCC在內(nèi)的多種癌癥相關，它的缺失會激活PI3K/AKT信號通路，導致人類多種癌癥的進展。PTEN長蛋白是PTEN的一個翻譯亞型，以非自主的方式在細胞內(nèi)起作用，最近有研究表明PTEN長蛋白主要與HCV病毒核心蛋白相互作用，以劑量依賴方式抑制HCV病毒的復制[25]；HBV病毒X蛋白被認為主要在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控病毒的復制[26]，它抑制了p53介導的PTEN的轉(zhuǎn)錄。以上病毒可能改變了PTEN的調(diào)節(jié)能力和促凋亡能力，從而加快腫瘤形成的進程[24]。這為開發(fā)更多抗肝炎病毒藥品提供機會，從而可能在一定程度上減少肝炎病毒相關PLC的發(fā)生。Shp2/Ptpn11是造血細胞中的原癌基因，它可以拮抗腫瘤抑制因子PTEN在白血病發(fā)生中的作用。Luo等[27]的研究向我們展示了Shp2和Pten在抑制PLC發(fā)生中的協(xié)同作用：他們同時敲除了肝細胞中的Shp2和PTEN基因，成功誘發(fā)早發(fā)性NASH并促進了肝腫瘤起始細胞的發(fā)生，這可能是cJun表達/激活增強以及肝微環(huán)境中ROS及炎癥水平升高所致。抑制cJun通路部分抑制NASH驅(qū)動的肝臟腫瘤發(fā)生但不改善NASH。他們也在預后不良的PLC患者中檢測到SHP2和PTEN的缺陷。這些數(shù)據(jù)描繪了PLC發(fā)生的機制并提出了潛在的治療策略。

2.1.3 p16與HCC p16基因位于染色體9p21上，是一種周期蛋白依賴性激酶抑制劑，它是由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成的細胞周期調(diào)控因子家族的一員，在細胞周期調(diào)控中起關鍵作用。最近頻繁報道在HCC中，p16啟動子的甲基化使得p16表達量發(fā)生了下調(diào)，這可能是由于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)DNMT1和DNMT3A在p16啟動子的甲基化中扮演了重要角色[28]。Lv等[29]的系統(tǒng)評價及薈萃分析也顯示肝癌與慢性肝炎及肝硬化相比p16啟動子有著更高的甲基化水平、年齡>50歲的病人比<50歲的病人高、攜帶HBV或HCV的HCC比未攜帶肝炎病毒的HCC高，而與性別、肝硬化、腫瘤分化、HCC的臨床分期無關。當然也有研究表明在HBV相關HCC中，乙肝病毒X蛋白(HBX)誘導p16啟動子區(qū)域的組蛋白H3賴氨酸9三甲基化(H3K9me3)且抑制特異性作用于H3K9me3的去甲基化酶JMJd2B，從而提高H3K9me3的水平。即HBX通過JMJd2B通路抑制p16基因的轉(zhuǎn)錄，達到使腫瘤抑制基因p16沉默的目的[30]。該研究為HBX誘導的p16基因轉(zhuǎn)錄沉默的機制提供了新的見解，JMJd2B可能是表觀遺傳治療HCC的潛在靶點。

2.1.4 nm23與HCC nm23是結(jié)構(gòu)及功能上保守的核糖核苷二磷酸激酶家族的一員，在人體中存在著兩種nm23基因：nm23-H1和nm23-H2。nm23-H1作為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，它與表達量與HCC的轉(zhuǎn)移成負相關。nm23-H1表達的喪失與轉(zhuǎn)移的程度相關，也與幾種人類的癌癥的不良臨床預后相關。Boissan等[31]通過在人肝癌細胞中沉默nm23-H1基因，調(diào)查了其對與癌癥發(fā)展相關的細胞黏附、遷移、侵襲、信號傳導的影響。該團隊發(fā)現(xiàn)了NM23-H1的沉默破壞了由E-鈣粘蛋白介導的細胞與細胞的黏附，導致了β-連環(huán)蛋白核移位和T細胞因子/淋巴增強因子-1反式激活。此外，NM23-H1沉默通過促進侵襲偽足形成和上調(diào)幾種基質(zhì)金屬蛋白酶(包括膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1)來促進細胞擴散、提高運動性和加強細胞外基質(zhì)入侵?？傊?，他們的研究揭示了NM23-H1對于控制上皮癌侵襲性程序早期階段細胞與細胞之間的黏附以及細胞遷移至關重要，并且可以形成障礙阻止原位癌轉(zhuǎn)化為侵襲性惡性腫瘤。至于NM23-H2，關于它的研究少于NM23-1，其亞細胞定位主要在胞質(zhì)中，而在細胞核內(nèi)較少。Lee等[32]將穩(wěn)定表達NM23-H2的NIH3T3成纖維細胞和HLK3肝細胞種植在無胸腺的小鼠中，使之產(chǎn)生了腫瘤并顯示c-Myc過表達。此外，NM23-H2也增加了NF-κB和cyclin D1的表達。該實驗組為了達到沉默NM23-H2基因的目的，通過構(gòu)建shRNA慢病毒載體抑制了來自HLK3細胞且穩(wěn)定表達NM23-H2的異種移植腫瘤的生長。總之，這些結(jié)果都提示了NM23-H2可能在腫瘤發(fā)生過程中充當原癌基因的角色。

2.1.5 SIRT6與HCC SIRT6是NAD+依賴的脫乙酰化酶Sirtuin家族的一員，參與調(diào)節(jié)基因組穩(wěn)定性、端粒完整性、轉(zhuǎn)錄和DNA修復，且與慢性炎癥、糖尿病、肝功能障礙、癌癥等相關。因為其復雜而又對立的功能角色，SIRT6被認為是健康和疾病的雙刃劍。近年來SIRT6被發(fā)現(xiàn)與多種癌癥的進展有關，一些研究認為SIRT6在結(jié)直腸癌、胰腺導管腺癌、頭頸癌中可能是一種腫瘤抑制基因，而另一些研究則表明SIRT6在皮膚癌、前列腺癌中可能是一種原癌基因，但是否與HCC相關，目前還不清楚。Ran等[33]通過實驗揭露了SIRT6在HCC中作為原癌基因的角色，SIRT6通過抑制BCL2相關的X蛋白(BAX)表達以及線粒體轉(zhuǎn)位來加強凋亡逃逸。近期他們進一步闡釋了SIRT6在HCC中可以阻斷BAX的線粒體移位，并通過Ku70的脫乙?；瘉斫档虷CC細胞的凋亡率[34]。同樣，Lee等[35]的研究表明SIRT6通過防止DNA損傷和細胞衰老而起到腫瘤啟動子的作用。綜上，我們看到了SIRT6作為治療HCC的潛在靶點的希望，不過其機制需要更多的研究來完善。

2.2 單核苷酸多態(tài)性(SNP)與HCC SNP是指基因水平單個核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性，是人類最常見的可遺傳基因變異。SNP作為標志物廣范圍分布于基因中，我們不僅可以從中反映出不同人種、人口、個體的基因差異。同樣也可以在疾病的風險評估、早期診斷、預防、治療等方面發(fā)現(xiàn)它的價值[36]。RYBP蛋白于1999年被發(fā)現(xiàn)，可抑制基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)控胚胎發(fā)育并在表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮作用，之后陸續(xù)有研究提示RYBP與多種癌癥相關，未見報道與HCC相關。最近，一項有關中國人的RYBP多態(tài)性研究表明，在HCC的發(fā)病發(fā)面，基因型為rs12956的RYBP起保護性作用，而rs2118593能夠增加HCC的發(fā)病風險；RYBP多態(tài)性與環(huán)境致病因素之間的相互作用在HCC發(fā)展發(fā)面扮演重要角色；此外，RYBP的SNPs之間的相互作用也可以增加HCC的患病風險。氧化應激被認為在誘導HBV或HCV感染相關HCC中扮演關鍵角色[37,38]，它可以引起DNA損傷，從而引發(fā)細胞的DNA損傷反應(DDR)。DDR基因的單核苷酸多態(tài)性可能影響個體對致癌因素的易感性以及影響DNA修復功效，從而影響患HCC的風險。

2.3 HCC的全基因組分析 基因序列的變異是所有惡性腫瘤發(fā)生密切相關的重要分子層次上的原因，我國于數(shù)年前加入了國際腫瘤基因組協(xié)作聯(lián)盟(ICGC)所倡導的腫瘤基因組研究并取得了多種癌癥相關進展。HCC作為最常見的惡性腫瘤之一同樣也進行了此研究。一項來自日本的300例PLC患者的全基因組分析確定了編碼區(qū)及非編碼區(qū)的點突變、結(jié)構(gòu)變異(STVs)和病毒的整合。他們發(fā)現(xiàn)了與PLC發(fā)生相關的突變特征以及經(jīng)常突變的編碼區(qū)和非編碼區(qū)，比如長基因間區(qū)非編碼RNA基因(NEAT1和MALAT1)、啟動子、CTCF結(jié)合位點和調(diào)控區(qū)；分析表明PLC與STVs密切關聯(lián)，這是因為STVs可反復影響復制時間以及已知PLC相關基因(CDKN2A、CCND1、APC、TERT)和新發(fā)現(xiàn)的基因(ASH1L、NCOR1、MACROD2)導致這些基因的表達量發(fā)生改變。該項研究強調(diào)了全基因組測序在發(fā)現(xiàn)變異驅(qū)動癌癥的發(fā)生以及全面了解PLC的分子發(fā)病機制的方面具有重要意義[39]。

2.4 miRNAs與HCC miRNAs是一類大小為18～23nt的短鏈非編碼RNA。自第一個miRNA在線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)后，相繼有多種miRNA在不同動植物體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，可調(diào)節(jié)生物體發(fā)育、調(diào)控細胞周期、參與細胞炎癥、增殖、凋亡等過程。最近也有多項研究表明一些miRNA可能充當抑制腫瘤的功能，而另一些miRNA則可能扮演致癌的作用。抑癌方面，具有組織特異性的miR-122在老鼠和人的總miRNAs中分別占70%和52%，在HCC組織及前臨床實驗研究中，通過miRNA表達改變的全基因組分析提示miR-122顯著降低；微陣列分析也比表明miR-122的下調(diào)促進了肝細胞的去分化。miR-122可能通過多個作用靶點與肝細胞炎癥、纖維化以及HCC細胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移發(fā)生聯(lián)系，但這僅僅是推測，需要更多有關研究來證實。此外，多人最近研究描述了未知的炎癥反饋回路，這一過程涉及到參與擴大PLC致癌信號的miRNAs和轉(zhuǎn)錄因子。miR-124(單獨或與miR-7一起)抑制反饋回路中的IL-6R和NF-κB(Rel-A)的活化，從而抑制HCC的發(fā)生。并且miR-124可以由于HNF-4α的喪失而表達減少，這樣促進了HCC的發(fā)生[40]。此外可能與肝癌發(fā)生相關的miRNAs還有miR-194和miR-370、miR-15、miR-26、miR-29、miR-155、miR-21、miR-224等[41]。

流行病學及多項研究表明肝癌的發(fā)生是一個由多種因素相互作用，經(jīng)歷多階段發(fā)展而來的的腫瘤。眾所周知，HBV和HCV相關的慢性肝損是導致HCC的最重要的原因，其他病因?qū)τ贖CC的貢獻較少。我們要增強公民黃曲霉素公共衛(wèi)生意識、加強實驗室及其監(jiān)測能力、建立早期預警體系、對農(nóng)民進行種植及管理能力訓練等都是至關重要的。充分理解自噬、炎癥、免疫這三者復雜的關系以及他們?nèi)绾伪蛔允稍鰪妱┧绊懀蛟S可以改善HCC免疫療法的效果。此外我們應該對發(fā)達國家和發(fā)展中國家日益增長的肥胖率予以密切關注，可能會導致HCC發(fā)病率的意外增加。因為HCC惡性程度較高且治療后易復發(fā)，目前其治療不盡如人意。機遇與挑戰(zhàn)并存是目前肝癌研究的現(xiàn)狀，需要我們齊心協(xié)力通過對其發(fā)病機制等多方面綜合且深入的研究，找到治療HCC的關鍵靶點，創(chuàng)新治療方法，相信在不久的將來HCC必將被人類所攻克。

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