周祉妤，昌建鈞，候亞鵬，丁炎，聶宏光

(中國醫(yī)科大學(xué)，沈陽110122)

間充質(zhì)干細胞(MSCs)是一種非造血成體干細胞，具有多向分化和自我更新能力[1]。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs能夠減輕肺組織損傷并促進其修復(fù)，可用于急性肺損傷、慢性阻塞性肺疾病、哮喘和肺纖維化等肺部疾病治療[2～5]。有研究表明，MSCs所分泌的因子是其發(fā)揮組織修復(fù)作用的關(guān)鍵[6～8]。骨髓間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基(BMSCs-CM)是用于MSCs培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，其內(nèi)含有MSC分泌的各種因子。2016年9月～2017年10月我們進行本研究，旨在探討B(tài)MSCs-CM對小鼠肺泡上皮細胞增殖的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性C57小鼠，SPF級，3周齡，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，動物合格證：SCXK(遼)2015-0001。肺泡Ⅱ型細胞(ATⅡ細胞)、人肺泡上皮細胞A549(上海復(fù)祥生物科技有限公司)；DMEM/F12、RPMI 1640、FBS(HyClone)，胰酶(Cellgro)，重組小鼠堿性成纖維細胞生長因子(PeproTech)，F(xiàn)ITC標記的CD34、APC標記的CD44(BD Pharmingen)，小鼠抗鈉通道蛋白α(α-ENaC)單克隆抗體(Abcam)，小鼠抗β-actin單克隆抗體(Santa Cruz)；RT-PCR 試劑盒(Qiagen)。

1.2 BMSCs分離、鑒定及BMSCs-CM獲取 將C57小鼠處死后用酒精浸泡消毒，暴露雙后肢肌肉，在膝關(guān)節(jié)處剪斷，取股骨，置于預(yù)冷的PBS中，剝離肌肉和筋膜，將剔除干凈的股骨放入預(yù)冷的PBS中。用2 mL含10% FBS、1%青霉素/鏈霉素及重組小鼠堿性成纖維細胞生長因子(10 ng/mL)的DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗股骨骨髓腔，直至沖洗干凈，即股骨發(fā)白，獲得骨髓細胞。將細胞置于37 ℃、5% CO2和95% O2條件下培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)液，隔日換液1次，待細胞融合70%～80%時傳代。

1.2.1 BMSCs培養(yǎng)及鑒定 選擇第2代生長狀態(tài)良好的細胞，37 ℃、0.25%胰酶消化，制備單細胞懸液，移入15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清；加入預(yù)冷的PBS，再次吹打混勻成細胞懸液，1 000 r/min 離心5 min，棄上清。細胞計數(shù)板計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果用PBS適當(dāng)調(diào)整懸液體積，使細胞密度為(1～10)×106個/mL。取300 μL細胞懸液置于裝有10 μL相應(yīng)抗體、FITC標記的CD34及APC標記的CD44的EP管中，流式細胞儀檢測。結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)的細胞CD44陽性表達率為92.5%，CD34陰性表達率為97.3%，提示分離培養(yǎng)的細胞為BMSCs，且其純度較高。

1.2.2 BMSCs-CM獲取 當(dāng)?shù)?代細胞生長融合70%～80%時，PBS清洗2～3次，加入無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h收集其培養(yǎng)基即為BMSCs-CM。將BMSCs-CM用0.22 μm濾器過濾后置于-20 ℃冰箱保存。

1.3 BMSCs和BMSCs-CM對A549細胞存活率的影響 將人肺泡上皮細胞A549體外常規(guī)培養(yǎng)，取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞按1.6×105個/孔接種于24孔板中，孔中加入10% FBS、1%青/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2、95% O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，吸去培養(yǎng)基，PBS清洗，加入無血清培養(yǎng)基饑餓處理12 h。加入含10% CCK-8的培養(yǎng)基，避光孵育1 h。PBS清洗3次，將24孔板中的細胞隨機分為對照組、無血清組、BMSCs組、BMSCs-CM組，每組設(shè)3個復(fù)孔。其中，對照組以含10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，無血清組以無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，BMSCs組加入已接種小鼠BMSCs的Transwell(細胞密度為8×104個/孔)用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基共培養(yǎng)，BMSCs-CM組以獲取的小鼠BMSCs-CM培養(yǎng)。以常規(guī)培養(yǎng)細胞為空白對照。培養(yǎng)24 h后吸去各組培養(yǎng)基，加入含10% CCK-8的RPMI 1640培養(yǎng)基，檢測各組光密度(OD)值，計算細胞相對存活率。細胞存活率=(實驗孔OD值-空白孔OD值)/(對照孔OD值-空白孔OD值)×100%。相對存活率=實驗組存活率/對照組存活率。

1.4 BMSCs-CM對ATⅡ細胞α-ENaC表達的影響 采用Real-time PCR法。體外常規(guī)培養(yǎng)ATⅡ細胞，用含10% FBS和1%青/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，待其生長融合70%～80%時，將細胞隨機分為DMEM/F12組、BMSCs-CM組，每組設(shè)4個復(fù)孔(1.6×105個/孔)。其中，DMEM/F12組以無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，BMSCs-CM組以獲取的小鼠BMSCs-CM培養(yǎng)24 h。PBS清洗3次，用TRIzol試劑提取總RNA，檢測RNA濃度。取5 μg總RNA通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析其純度。取1 000 ng總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物應(yīng)用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃、30 s，單循環(huán)；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40個循環(huán)。α-ENaC引物：上游引物5′-AACAAATCGGACTGCTTCTAC-3′，下游引物5′-AGCCACCATCATCCATAAA-3′，產(chǎn)物大小為406 bp。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算α-ENaC相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs和BMSCs-CM對A549細胞存活率的影響 無血清組細胞相對存活率為(80.70±0.70)%，BMSCs組為(85.83±1.98)%，BMSCs-CM組為(91.28±1.91)%，BMSCs組與BMSCs-CM組細胞相對存活率均高于無血清組(P<0.05或<0.01)，BMSCs組與BMSCs-CM組比較P>0.05。

2.2 BMSCs-CM對ATⅡ細胞α-ENaC表達的影響 DMEM/F12組α-ENaC相對表達量為1.00±0.00，BMSCs-CM組為3.16±1.50，兩組比較P<0.05。

3 討論

MSCs是一種非造血成體干細胞，具有多向分化和自我更新能力，廣泛存在于骨髓、臍帶、臍血、外周血、脂肪等組織中[1]，可用于修復(fù)或替代受損和病變的多種組織器官[9,10]。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs的旁分泌效應(yīng)(即將相關(guān)因子分泌到培養(yǎng)基)具有抗炎、抗菌和調(diào)節(jié)肺通透性的作用，其作用機制主要涉及增加抗炎介質(zhì)、減少促炎性因子分泌的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)、分泌生長因子的屏障修復(fù)效應(yīng)、肺泡液體清除效應(yīng)以及肺泡上皮細胞凋亡的抑制效應(yīng)等[11～14]。 BMSCs-CM是MSCs在無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后收集其培養(yǎng)基所獲得的條件培養(yǎng)基，它含有MSCs分泌的各種因子。由于MSCs旁分泌對肺泡上皮細胞Na+運輸有一定的調(diào)節(jié)作用，并且能夠恢復(fù)頂側(cè)膜對Na+的運輸，因此我們推測其對ENaC亦有一定的調(diào)控作用。隨著干細胞科學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，MSCs旁分泌效應(yīng)的應(yīng)用范圍逐漸擴大，近年來已經(jīng)成為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)組織器官損傷修復(fù)以及再生領(lǐng)域研究的熱點。

急性肺損傷是指由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的肺部炎性反應(yīng)，其肺泡毛細血管上皮細胞及肺部屏障結(jié)構(gòu)受損，肺氣體交換功能發(fā)生障礙，是一種以急性、進行性、頑固性低氧血癥為特征的臨床綜合征，是目前導(dǎo)致危重患者死亡的主要原因[15]。急性肺損傷的臨床特征之一是嚴重肺水腫，肺泡內(nèi)液體清除與肺水腫密切相關(guān)，增強肺泡內(nèi)液體清除即加速肺泡內(nèi)積聚液體的清除，有助于減輕肺水腫病情[16]。肺泡內(nèi)的液體由肺泡上皮的ENaC、水通道蛋白和鈉鉀腺苷三磷酸酶進行清除[1,9,15]。其中ENaC是其最主要的方式。ENaC最初是由Canessa等[17]從鼠結(jié)腸上皮細胞中克隆出來的。隨著研究的不斷深入，人們在腎臟、結(jié)腸、肺臟、大腦、卵巢、睪丸和胰腺等組織相繼發(fā)現(xiàn)了ENaC表達[17～19]。人體中的ENaC由四種亞基組成，分別為α、β、γ和δ，其生理功能是跨越緊密連接上皮單向轉(zhuǎn)運鈉離子，調(diào)節(jié)水和離子的轉(zhuǎn)運[20]。ENaC表達降低將導(dǎo)致肺水腫形成，因此調(diào)控ENaC對急性肺損傷患者的肺水腫清除至關(guān)重要[21]。

本研究通過CCK-8細胞增殖實驗驗證了BMSCs與肺泡上皮細胞共培養(yǎng)以及BMSCs-CM均能使肺泡上皮細胞的生存能力增強，由此推測BMSCs及其條件培養(yǎng)基可能通過提高肺泡上皮細胞的生存能力從而介導(dǎo)對急性肺損傷的治療作用，同時也驗證了MSCs的旁分泌效應(yīng)對細胞增殖發(fā)揮了重要作用。由于BMSCs-CM中含有MSCs分泌的各種因子，因此我們推測其分泌的一些特異性生長因子可能參與其中，具體機制有待于進一步研究。

ENaC表達變化對于急性肺損傷的發(fā)生、發(fā)展極其重要，α亞基是ENaC主要的功能亞單位。本研究結(jié)果顯示BMSCs-CM能夠使α-ENaC表達升高，證明BMSCs-CM對肺泡上皮細胞有保護作用。由此推測，BMSCs-CM可通過調(diào)控α-ENaC表達進而調(diào)節(jié)肺泡液體清除率，可對水腫型急性肺損傷起到一定的治療作用。

綜上所述，BMSCs-CM可促進肺泡上皮細胞增殖，其機制可能與促進肺泡Ⅱ型細胞α-ENaC表達有關(guān)。

參考文獻：

[1] Ware LB,Matthay MA. Alveolar fluid clearance is impaired in the majority of patients with acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome[J]. Am J Respir Crit Care Med,2001,163(15):1376-1383.

[2] Ortiz LA,Dutreil M,Fattman C,et al. Interleukin 1 receptor antagonist mediates the antiinflammatory and antifibrotic effect of mesenchymal stem cells during lung Injury[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(26):11002-11007.

[3] Danchuk S,Ylostalo JH,Hossain F,et al. Human multipotent stromal cells attenuate lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice via secretion of tumor necrosis factor-α-induced protein 6[J]. Stem Cell Res Ther,2011,2(3):27.

[4] Guan XJ,Song L,Han FF,et al. Mesenchymal stem cells protect cigarette smoke-damaged lung and pulmonary function partly via VEGF-VEGF receptors[J]. J Cell Biochem,2013,114(2):323-335.

[5] Wang H,Yang YF,Zhao L,et al. Hepatocyte growth factor gene-modified mesenchymal stem cells reduce radiation-induced lung injury[J]. Hum Gene Ther,2013,24(3):343-353.

[6] Helena KS. Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome[J]. Biochimie,2013,95(12):2196-2211.

[7] Goolaerts A,Pellan-Randrianarison N,Larghero J,et al. Conditioned media from mesenchymal stromal cells restore sodium transport and preserve epithelial permeability in an in vitro model of acute alveolar injury[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2014,306(11):L975-L985.

[8] Downs CA,Trac DQ,Kreiner LH,et al. Ethanol alters alveolar fluid balance via nadph oxidase (NOX) signaling to epithelial sodium channels (ENaC) in the lung[J]. PLoS One,2013,8(1):e54750.

[9] Berthiaume Y,Matthay MA. Alveolar edema fluid clearance and acute lung injury[J]. Respir Physiol Neurobiol,2007,159(3):350-359.

[10] Williams AR,Hare JM. Mesenchymal stem cells: biology,pathophysiology,translational findings,and therapeutic implications for cardiac disease[J]. Circ Res,2011,109(8):923-940.

[11] Lee JW,Fang X,Krasnodembskaya A,et al. Concise review: mesenchymal stem cells for acute lung injury: role of paracrine soluble factors[J]. Stem Cells,2011,29(6):913-919.

[12] Krasnodembskaya A,Song Y,Fang X,et al. Antibacterial effect of human mesenchymal stem cells is mediated in part from secretion of the antimicrobial peptide LL-37[J]. Stem Cells,2010,28(12):2229-2238.

[13] Fang X,Neyrinck AP,Matthay MA,et al. Allogeneic human mesenchymal stem cells restore epithelial protein permeability in cultured human alveolar type Ⅱ cells by secretion of angiopoietin-1[J]. J Biol Chem,2010,285(34):26211-26222.

[14] Lee JW,Krasnodembskaya A,Mckenna DH,et al. Therapeutic effects of human mesenchymal stem cells in ex vivo human lungs injured with live bacteria[J]. Am J Respir Crit Care Med,2013,187(7):751-760.

[15] Jiang L,Fei D,Gong R,et al. CORM-2 inhibits TXNIP/NLRP3 inflammasome pathway in LPS-induced acute lung injury[J]. Inflamm Res,2016,65(11):905-915.

[16] Deng J,Wang D,Liang A,et al. Effects of baicalin on alveolar fluid clearance and α-ENaC expression in rats with LPS-induced acute lung injury[J]. Can J Physiol Pharmacol,2017,95(2):122-128.

[17] Canessa CM,Schild L,Buell G,et al. Amiloride-sensitive epithelial Na+channel is made of three homologous subunits[J]. Nature,1994,367(6462):463-467.

[18] Kashlan OB,Kleyman TR. Epithelial Na(+) channel regulation by cytoplasmic and extracellular factors[J]. Exp Cell Res,2012,318(9):1011-1019.

[19] Thibodeau PH,Butterworth MB. Proteases,cystic fibrosis and the epithelial sodium channel (ENaC)[J]. Cell Tissue Res,2013,351(2):309-323.

[20] Qadri YJ,Rooj AK,Fuller CM. ENaCs and ASICs as therapeutic targets[J]. Am J Physiol Cell Physiol,2012,302(7):C943-C965.

[21] Althaus M,Clauss WG,Fronius M. Amiloride-sensitive sodium channels and pulmonary edema[J]. Pulm Med,2011,2011:830320.