黨如意，趙晨陽(yáng)，樊興，趙子龍，蔣新格，李革

(重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶400016)

吸煙是目前公認(rèn)的慢性阻塞性肺疾病(COPD)和肺癌的首要致病危險(xiǎn)因素。但香煙煙霧的致病機(jī)制尚不十分清楚，且鮮見(jiàn)從微生物角度研究吸煙導(dǎo)致肺部疾病的機(jī)制。香煙煙霧中的主要致癌成分之一是多環(huán)芳香化合物[1]。研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者吸入富含多環(huán)芳烴煙霧者相比于吸入含少量多環(huán)芳烴煙霧者，下呼吸道菌群操作分類單位(OTU)數(shù)值減少，即細(xì)菌物種數(shù)減少[2]。研究發(fā)現(xiàn)，健康人群中吸煙者咽部細(xì)菌檢出率高于非吸煙者[3]。煙草本身含有一些病原體，包括多種細(xì)菌和真菌等[4]。以上事實(shí)均提示香煙煙霧暴露對(duì)下呼吸道菌群分布有一定影響。目前關(guān)于香煙煙霧暴露對(duì)下呼吸道菌群分布影響的研究多為臨床研究[1，5,6]，樣本量較少，混雜因素不容易控制，更重要的是獲取下呼吸道菌群的方法不完善。故多數(shù)研究結(jié)果可信度不高。2016年10月～2017年3月，本研究觀察了香煙煙霧暴露對(duì)正常小鼠下呼吸道菌群分布的影響?，F(xiàn)分析結(jié)果并報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 雌性昆明系小鼠10只，SPF級(jí)，體質(zhì)量20～22 g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。五牛牌香煙。染毒缸(圓柱體，底直徑70 cm，高80 cm)、海利超靜強(qiáng)力氣泵(型號(hào)V10，功率10 W，壓力>0.02 MPa，排氣量10 L/min)、高壓蒸汽滅菌鍋、研缽、剪刀、鑷子。

1.2 小鼠分組及香煙煙霧暴露 將10只小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各5只。實(shí)驗(yàn)組每天進(jìn)行1次、每次2 h的香煙煙霧暴露。暴露方式：小鼠置于染毒柜中，一次性點(diǎn)燃5支香煙，使染毒柜內(nèi)迅速達(dá)到較高的煙霧濃度，然后每隔半小時(shí)點(diǎn)3支香煙，整個(gè)染毒過(guò)程持續(xù)2 h。微型真空泵持續(xù)將外界空氣泵入染毒缸保證小鼠不出現(xiàn)死亡。肉眼可見(jiàn)容器內(nèi)充滿大量白色煙霧。暴露持續(xù)70天。對(duì)照組不做處理，自由進(jìn)食飲水。

1.3 下呼吸道菌群分布檢測(cè) 停止煙霧暴露15天將10只小鼠斷頸處死，用剪刀和鑷子取出小鼠肺部，置于研缽中，加入少量蒸餾水研磨至無(wú)明顯肉眼可見(jiàn)組織，置于-20 ℃冰箱保存。標(biāo)本送凌恩公司采用Illumina Miseq平臺(tái)行16S rRNA Ⅴ3～Ⅴ4區(qū)測(cè)序。主要步驟包括基因組DNA提取、設(shè)計(jì)并合成引物、PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純化、PCR產(chǎn)物定量和均一化、MiSeq PE文庫(kù)制備、MiSeq高通量測(cè)序。檢測(cè)兩組下呼吸道菌群組成并測(cè)算各組分相對(duì)豐度。相對(duì)豐度即該菌群豐度占總菌群豐度的比例。相對(duì)豐度大于1%即為優(yōu)勢(shì)菌屬。

1.4 兩組下呼吸道菌群分布分析

1.4.1 α多樣性分析 應(yīng)用Mothur軟件(http://www.mothur.org/)中的summary.single命令，計(jì)算4種常用的生物多樣性指數(shù)：Chao、Simpson、Shannon和Coverage指數(shù)。Simpson指數(shù)常用來(lái)描述一個(gè)區(qū)域的生物多樣性，Simpson指數(shù)越大，說(shuō)明群落多樣性越低。Chao、Shannon指數(shù)是用不同算法估計(jì)樣本中所含OTU數(shù)目的指數(shù)，在生態(tài)學(xué)中常用來(lái)估計(jì)物種總數(shù)。Coverage指數(shù)是指各樣本文庫(kù)的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測(cè)出的概率越高，而沒(méi)有被測(cè)出的概率越低。該指數(shù)反映本次測(cè)序結(jié)果是否代表樣本中微生物的真實(shí)情況。

1.4.2 稀釋曲線分析 稀釋曲線是從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的個(gè)體，統(tǒng)計(jì)這些個(gè)體所代表的物種數(shù)目，并以個(gè)體數(shù)和物種數(shù)來(lái)構(gòu)建曲線。它既可用來(lái)比較測(cè)序數(shù)據(jù)量不同樣本中物種的豐富度，也可用來(lái)說(shuō)明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理。根據(jù)獲得的OTU數(shù)據(jù)，以測(cè)序樣本的序列數(shù)為橫坐標(biāo)，得到的OUT數(shù)值作為縱坐標(biāo)，繪出每個(gè)樣本的稀釋曲線，當(dāng)曲線趨于平坦時(shí)，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU，反之則表明繼續(xù)測(cè)序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。稀釋曲線可反映樣本的測(cè)序深度。

1.4.3 物種豐度差異分析 采用LEFSe軟件根據(jù)分類學(xué)組成對(duì)樣品按照不同的分組條件進(jìn)行線性判別分析，找出對(duì)樣品劃分產(chǎn)生顯著性影響的群落或物種。此次研究在界、門(mén)、綱、目、科、屬這6個(gè)層次上對(duì)同類的OTU進(jìn)行聚類，通過(guò)LEFSe檢測(cè),可在進(jìn)化分枝樹(shù)圖上展示在各個(gè)層次水平中有組間差異的微生物群落或者物種。統(tǒng)計(jì)在兩組中豐度有差異且LDA值大于2的菌群。應(yīng)用軟件MEGAN4(http://ab.inf.uni-tuebingen.de/software/megan/)生成物種進(jìn)化樹(shù)及豐度信息。

1.4.4 PCA分析 即主成分分析。通過(guò)分析不同樣本OTU組成找到數(shù)據(jù)中最主要的元素和結(jié)構(gòu)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 兩組生物多樣性指數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組同屬細(xì)菌物種豐度差異分析使用Metastats分析法[7]。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組下呼吸道主要菌屬及其相對(duì)豐度 對(duì)照組下呼吸道主要菌屬按相對(duì)豐度從高到低依次為鹽單胞菌(相對(duì)豐度70.8%)、Enterobacteriaceae_unclassified(相對(duì)豐度2.5%)、腸桿菌(相對(duì)豐度2.3%)、Pelagibacterium(相對(duì)豐度2.1%)、涅斯捷連科氏菌(相對(duì)豐度1.8%)、葡萄球菌(相對(duì)豐度1.4%)、芽孢桿菌(相對(duì)豐度1.2%)、Gemmatimonadaceae_uncultured(相對(duì)豐度1.1%)、副球菌(相對(duì)豐度0.8%)、紅桿菌(相對(duì)豐度0.7%)、棒狀桿菌(相對(duì)豐度0.6%)、Saccharibacteria_norank(相對(duì)豐度0.4%)、Zoogloea(相對(duì)豐度0.4%)，實(shí)驗(yàn)組上述菌屬相對(duì)豐度分別為46.8%、2.9%、2.5%、3.9%、0.9%、0.4%、0.3%、1.0%、19.3%、1.5%、1.5%、1.4%、1.2%。兩組優(yōu)勢(shì)細(xì)菌十分相似。最主要的菌屬均為鹽單胞菌屬，雖然菌屬相對(duì)豐度差異較大，但經(jīng)Metastats分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組棒狀桿菌屬差異也較大，主要是由于實(shí)驗(yàn)組有一只小鼠棒狀桿菌屬相對(duì)豐度為85.9%，這可能是受環(huán)境影響所致。

2.2 兩組下呼吸道菌群的α多樣性 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組Chao指數(shù)分別為603±77、388±67，兩組比較P>0.05。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組Shannon指數(shù)分別為2.29±1.03、1.82±1.23，Simpson指數(shù)分別為0.40±0.21、0.53±0.28，兩組比較P均>0.05。兩組Coverage指數(shù)為0.990～0.999。

2.3 兩組下呼吸道菌群的稀釋曲線 雖然樣本序列增大，但OTU變化不大。

2.4 兩組下呼吸道菌群物種豐度的差異性 兩組物種豐度有差異且LDA值大于2的菌群包括Lactobacillales目、Streptococcaceae科、Negativicutes綱、Selenomonadales科、Streptococcus屬、Enterococcaceae科、Enterococcus屬、Nordella屬、CandidatusAccumulibacter屬、Ilumatobacter屬。Metastats軟件分析發(fā)現(xiàn)，在屬的水平上，兩組共16種菌屬的物種相對(duì)豐度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但存在差異的菌群相對(duì)豐度均小于1%。其常見(jiàn)的致病菌Enterococcus(腸球菌)豐度與相對(duì)豐度均有輕度上升。

2.5 兩組下呼吸道菌群PCA分析 對(duì)照組菌群組成較為相似，實(shí)驗(yàn)組則差異明顯。

3 討論

研究表明，生活在人體中的細(xì)菌數(shù)量大約為人體細(xì)胞數(shù)量的10倍[8]。下呼吸道菌群與肺部疾病之間的關(guān)系是目前臨床研究的熱點(diǎn)之一。目前已經(jīng)在吸煙者和不吸煙者的肺組織和支氣管灌洗液中均發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌群落[5]。而且還發(fā)現(xiàn)下呼吸道菌群與COPD、肺癌、哮喘和囊性纖維化密切相關(guān)[2，5,9]。盡管在人體內(nèi)生長(zhǎng)著大量細(xì)菌，但是憑借現(xiàn)在的技術(shù)，其中70%以上的細(xì)菌并不能被培養(yǎng)，20%～30%的細(xì)菌難以培養(yǎng)[10]。所以使用傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)的辦法對(duì)下呼吸道菌群分布進(jìn)行研究，結(jié)果并不可靠。本研究應(yīng)用基于PCR擴(kuò)增技術(shù)的16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)和Illumina Misep高通量測(cè)序平臺(tái)，基本完全覆蓋特定可變區(qū)，準(zhǔn)確地獲得微生物群落多樣性的信息，測(cè)序原理精確、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性高，用于研究復(fù)雜樣本的微生物群落的組成，具有先進(jìn)性[11]。

本研究結(jié)果顯示，兩組下呼吸道菌群Shannon、Chao、Simpson指數(shù)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明短時(shí)間(70天)、大劑量(14支)香煙煙霧暴露對(duì)小鼠下呼吸道菌群多樣性和物種豐度并無(wú)明顯影響。因小鼠下呼吸道菌群較穩(wěn)定，故此結(jié)論比較可靠。通過(guò)PCA分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組菌群組成較為相似，實(shí)驗(yàn)組菌群組成則差異明顯。這表明香煙煙霧影響了菌群組成。通過(guò)Metastats分析發(fā)現(xiàn)，兩組有16種菌屬相對(duì)豐度存在差異，但相對(duì)豐度均不足1%。表明香煙煙霧暴露對(duì)小鼠下呼吸道菌群結(jié)構(gòu)有一定影響，但影響有限。非優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度少，在不同個(gè)體之間差異較大，且此次研究樣本量較少，所以此次研究只能提示煙霧暴露對(duì)于少量菌群存在影響，但是否是上述菌群還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量觀察。

盡管目前并未有研究表明香煙煙霧對(duì)下呼吸道菌群多樣性有影響。但我們認(rèn)為并不能認(rèn)定香煙煙霧對(duì)下呼吸道菌群多樣性無(wú)影響。因?yàn)榻】等宋鼰熣吲c非吸煙者下呼吸道菌群多樣性之所以相似，可能只是因?yàn)槲鼰煏r(shí)間短和吸煙量少。同樣，本次研究可能由于染毒時(shí)間有限而導(dǎo)致結(jié)果差異不大。本研究還發(fā)現(xiàn)，小鼠下呼吸道有著較豐富的菌群。正常小鼠下呼吸道菌群中數(shù)量在前三的菌屬為鹽單胞菌、Enterobacteriaceae_Unclassified、腸桿菌，相對(duì)豐度依次為70.8%、2.5%、2.3%。這為今后的研究積累了資料。

高通量16S rRNA測(cè)序技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)可更準(zhǔn)確全面地識(shí)別細(xì)菌，但卻不能區(qū)分有活力的細(xì)菌和死亡的細(xì)菌。所以16sRNA測(cè)序技術(shù)與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)在檢測(cè)下呼吸道菌群分布方面應(yīng)該是相輔相成的，而不是前者替代后者的關(guān)系。本次研究表明，香煙煙霧可使腸球菌的豐度和相對(duì)豐度均輕度上升。腸球菌是分布在人和動(dòng)物的口腔和腸道的正常菌群，可導(dǎo)致院內(nèi)獲得性肺炎。腸球菌的毒力因子包括膠原蛋白黏附素、聚集物質(zhì)、溶血素、絲氨酸蛋白酶。這些毒力因子可幫助腸球菌破壞宿主細(xì)胞并引起宿主免疫反應(yīng)[12]。通過(guò)PCA分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組菌群組成更加相似，實(shí)驗(yàn)組菌群組成差異明顯。這表明香煙煙霧打破了原有正常菌群與宿主的平衡。提示香煙煙霧可輕微改變菌群，可能引起宿主的免疫反應(yīng)改變[13],但具體引起宿主何種免疫反應(yīng)的改變尚待進(jìn)一步研究。鑒于宿主免疫反應(yīng)異常是促進(jìn)COPD病情進(jìn)展的重要原因[14]，故推測(cè)香煙煙霧可能通過(guò)增加致病菌的生長(zhǎng)繁殖速度和改變下呼吸道菌群整體組成，引起宿主下呼吸道免疫反應(yīng)改變，從而導(dǎo)致或者促進(jìn)肺部疾病的發(fā)生。

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