王志杰，劉麗娜，劉霞，張錚，王天儀，郭曉玲

(1承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北承德067000；2中國人民解放軍第二六六醫(yī)院)

急性橫貫性脊髓炎(ATM)是脊髓結(jié)構(gòu)損傷導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)功能障礙的一種疾病，多發(fā)生于兒童。miRNA是一種具有翻譯調(diào)節(jié)功能的非編碼小RNA，對信使RNA具有調(diào)節(jié)作用，與機體生長、發(fā)育、衰老和疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。文獻報道，miR-454-3p可影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者預(yù)后，miR-454-3p高表達者神經(jīng)功能恢復(fù)較差[2]。前期研究顯示，ATM患兒腦脊液miR-454-3p表達升高，可能與ATM發(fā)生有關(guān)，但其具體機制并不明了。生長相關(guān)蛋白43(GAP-43)多表達于發(fā)育過程或損傷后再生過程中神經(jīng)細胞軸突生長錐末端，其主要功能是參與軸突生長和突觸重構(gòu)[3]。神經(jīng)細胞GAP-43表達隨著神經(jīng)系統(tǒng)的逐漸成熟而下降，但在發(fā)育成熟的神經(jīng)系統(tǒng)損傷中伴隨軸突的損傷修復(fù)會出現(xiàn)GAP-43表達上調(diào)[4～6]。2016年12月～2017年8月，本研究觀察了miR-454-3p表達對大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞軸突生長能力的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：出生3天的Wistar大鼠5只，雌雄不限，由天津市放射研究所提供，大鼠神經(jīng)細胞分離、培養(yǎng)及鑒定在天津翼駿生物科技有限公司實驗中心細胞室完成。飼養(yǎng)條件符合各等級動物的衛(wèi)生質(zhì)量要求。主要試劑：細胞用培養(yǎng)基購自上海立菲生物技術(shù)有限公司，胎牛血清購自美國Life technology公司，Lipofectmin2000與miRNA模擬物購自美國Genscript公司，RNA提取試劑盒、熒光染料與化學發(fā)光試劑購自大連寶生物工程有限公司，試驗用抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞分離、培養(yǎng)及分組干預(yù) 取出生3天的Wistar大鼠5只，無菌條件下取出并分離背根神經(jīng)節(jié)細胞，放入D/F12+10% FBS培養(yǎng)基中，置入24孔板。待背根神經(jīng)節(jié)細胞貼壁后，采用Neurobasal+B27培養(yǎng)基培養(yǎng)3天。將細胞隨機分為miR-454-3p過表達組及陰性對照組，采用Lipofectmin2000分別轉(zhuǎn)染miR-454-3p模擬物及其陰性對照序列。

1.3 背根神經(jīng)節(jié)細胞軸突長度檢測 采用免疫熒光技術(shù)。兩組轉(zhuǎn)染72 h，按照1×106/孔接種至6孔板，加入1 mL 4%多聚甲醛液，室溫下固定15 min，PBST液沖洗2 min×3遍；0.5% Triton X-100液孵育10 min，PBST液沖洗2 min×3遍。加入封閉血清孵育30 min，棄去廢液加入兔抗大鼠GAP-43(1∶200)，4 ℃過夜，PBST液沖洗2 min×3遍；加入Cy3標記的免疫熒光二抗，37 ℃孵育30 min，PBST液沖洗5 min×3遍；加入DAPI核染液，37 ℃條件下孵育30 min，自來水沖洗10 min；甘油封片，熒光顯微鏡照相。采用Image-pro plus6.0軟件分析圖像，隨機取5張圖片，每張圖片隨機取5個不同視野，每組測量250個神經(jīng)細胞的軸突長度，取平均值。

1.4 miR-454-3p靶基因預(yù)測 應(yīng)用TargetScan數(shù)據(jù)庫(http://www.targetscan.org/)進行miR-454-3p靶基因預(yù)測。打開TargetScan，在物種中選擇人類，在搜索框中輸入miR-454-3p后提交，系統(tǒng)運行后出現(xiàn)miR-454-3p可調(diào)控的靶基因。結(jié)果顯示，miR-454-3p的靶基因可能為GAP-43，其seed match值為7mer-m8，PCT值為0.79。

1.5 背根神經(jīng)節(jié)細胞GAP-43蛋白表達 采用Western bloting法。取兩組轉(zhuǎn)染72 h細胞，RIPA裂解，加入蛋白酶抑制劑，離心分離蛋白質(zhì)。使用SDS-聚丙烯酰胺電泳凝膠對蛋白樣品進行分離，并且轉(zhuǎn)膜到硝酸纖維素膜上。加入兔抗大鼠GAP-43、NADPH(稀釋比例分別為1∶2 000、1∶1 000)4 ℃過夜，PBST液沖洗2 min×3遍；加入Cy3標記的免疫熒光二抗，37 ℃孵育30 min，PBST液沖洗5 min×3遍；加入DAPI核染液，37 ℃條件下孵育30 min。加入ECL化學發(fā)光試劑進行曝光，采用Image-pro plus6.0檢測條帶灰度值，以NADPH為內(nèi)參計算兩組GAP-43蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

miR-454-3p過表達組與陰性對照組背根神經(jīng)節(jié)細胞軸突長度分別為(52.73±13.26)、(172.41±28.17)μm，GAP-43蛋白相對表達量分別為0.73±0.09、1.00±0.12，兩組比較P均<0.05。

3 討論

神經(jīng)細胞軸突可用于傳導(dǎo)神經(jīng)沖動，建立有效的神經(jīng)回路以精確傳遞感覺運動信息。ATM患者脊髓病變部位軸突變性崩解，導(dǎo)致神經(jīng)細胞沖動傳導(dǎo)減弱甚至消失，從而引起感覺及運動功能障礙。ATM的發(fā)生過程伴隨脊髓中上行和下行傳導(dǎo)纖維束破壞，軸突斷裂與其神經(jīng)元胞體分離并導(dǎo)致了“華納變性”[7]。miRNA的發(fā)現(xiàn)使得基因表達和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路靶點的精確調(diào)控成為可能[8,9]。研究報道，抑制長鏈非編碼RNA HOTAIR可增加miR-454-3p表達，從而抑制軟骨肉瘤細胞生長[10]。有研究證實，應(yīng)用miR-454-3p下調(diào)BTG1基因表達能夠提高腎癌細胞的放射敏感性[11]。Shao等[2]認為，miR-454-3p可影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者預(yù)后，miR-454-3p高表達提示神經(jīng)功能恢復(fù)較差。前期研究顯示，ATM患兒腦脊液miR-454-3p相對表達量明顯升高，說明miR-454-3p表達升高可能參與了ATM的發(fā)生與發(fā)展，但其機制仍需進一步探討。

背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元是研究中樞神經(jīng)損傷修復(fù)比較理想的工具細胞，因為首先其中樞突本身是中樞神經(jīng)重要組成部分，其次中樞神經(jīng)因疾病產(chǎn)生病理生理反應(yīng)時背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中樞突軸突斷裂，髓鞘崩解，但其胞體自身很少發(fā)生凋亡[12,13]。本研究結(jié)果顯示，miR-454-3p過表達組背根神經(jīng)節(jié)細胞軸突長度明顯短于陰性對照組，說明miR-454-3p過表達可抑制大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞軸突生長。GAP43在成年哺乳動物神經(jīng)元軸突損傷的再生過程中發(fā)揮重要作用，可使神經(jīng)元獲得一定再生的能力。GAP43能夠調(diào)節(jié)生長錐肌動蛋白活性，使生長錐更具活力。除此之外，GAP43蛋白還可以阻止生長錐回縮，為再生軸突提供導(dǎo)向，脊髓損傷后GAP43蛋白表達上升不但可促進神經(jīng)元軸突出芽，還能增強其可塑性，并促進神經(jīng)遞質(zhì)釋放。本研究結(jié)果顯示，miR-454-3p的靶基因可能為GAP-43；miR-454-3p過表達組GAP-43相對表達量明顯低于陰性對照組，說明miR-454-3p可能通過負向調(diào)控GAP-43表達而參與ATM的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，miR-454-3p表達升高可抑制大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞軸突生長，其機制可能與降低GAP-43表達有關(guān)。

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