熊妍，朱莉，吳芳草，陳芳，郭長城，楊凈，劉芳，陳崢宏

(1貴陽市兒童醫(yī)院，貴陽550002；2貴州醫(yī)科大學(xué)微生物教研室)

幽門螺桿菌(HP)是一種微需氧、弧形或螺旋狀的革蘭陰性菌，定植于人的胃黏膜，是引起慢性胃炎、十二指腸潰瘍等上消化道疾病的重要病原體，而且與胃癌、胃黏膜相關(guān)性淋巴樣淋巴瘤等發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系[1,2]。HP感染通常開始于兒童時期，在兒童時期根除HP有助于降低胃腸道疾病甚至胃癌的發(fā)病率[1,3]。目前國內(nèi)外兒童HP根除率在63.9%～93.0%，不能完全根除HP的主要原因是HP耐藥。研究證實，HP克拉霉素耐藥與23S rRNA基因V區(qū)上的點突變有關(guān)，此位點突變的發(fā)生率有明顯地區(qū)差異[4]。本研究觀察了貴陽地區(qū)胃部疾病患兒HP耐藥性及其23S rRNA基因V區(qū)突變情況，旨在為根除HP治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 研究對象為2015年8月～2017年6月因消化道癥狀于貴陽市兒童醫(yī)院就診的患兒561例，男304例、女257例，年齡11個月～15歲；主要癥狀為惡心、腹痛、嘔吐、腹脹、燒心、反酸、消化道出血等。患兒就診前未進(jìn)行根除HP治療，入院后均行胃鏡檢查。本研究已獲得貴陽市兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患兒家長均知情同意且簽署知情同意書。

1.2 胃黏膜組織HP分離、培養(yǎng)和鑒定 胃鏡檢查過程中用無菌活檢鉗夾取患兒胃竇部黏膜1塊，迅速置于HP尿素酶試紙上，試紙組織邊緣1 min內(nèi)由黃色變?yōu)闄鸭t色為強陽性，3 min內(nèi)變成櫻紅色為弱陽性，不變色為陰性。取HP尿素酶試紙檢測結(jié)果為強陽性或者弱陽性的新鮮胃黏膜組織，用無菌研磨器研磨成組織懸液，取100 μL接種于10%哥倫比亞血瓊脂平板上，置于厭氧罐內(nèi)，放置微需氧產(chǎn)氣袋后密封厭氧罐，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。5～7天后挑取瓊脂平板上透明針尖樣可疑菌落，經(jīng)革蘭染色初步鑒定后，挑取單菌落傳代培養(yǎng)，取培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色、氧化酶試驗、脲酶試驗和觸酶試驗，均陽性者鑒定為HP。561例患兒共分離出HP 49株。

1.3 HP菌株耐藥性檢測 采用E-test藥敏試驗。對用界值法檢測判為耐藥的菌株再用E-test法檢測MIC值。用1 000 μL移液器取100 μL HP懸液，置于直徑75 mm的平板上，然后用L形玻璃涂布棒把HP懸液均勻涂布在平板上，放置10 min，將抗生素E-test試條貼在MH血瓊脂表面，37 ℃、微需氧培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為72 h。橢圓形抑菌環(huán)和E-test試條的交界點藥物濃度值就是所需的MIC值。耐藥判斷標(biāo)準(zhǔn)：甲硝唑MIC高于32 μg/mL、四環(huán)素MIC高于16 μg/mL、克拉霉素MIC高于1 μg/mL、左氧氟沙星MIC高于1 μg/mL、阿莫西林MIC高于1 μg/mL。以敏感HP菌株NCTC11637進(jìn)行質(zhì)控。

1.4 克拉霉素耐藥HP菌株23S rRNA基因V區(qū)突變情況檢測 采用直接測序法。采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，根據(jù)試劑盒說明書操作提取HP菌株的DNA，- 20 ℃保存?zhèn)溆?。采用PCR法檢測。引物由Primer blast 設(shè)計，正向引物：5′-TGGCGTAACGAGATGGGAGCTGT-3′，反向引物：5′-AGTCTTTGTGCGAGCTTAGGGA-3′。PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性、5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈照射下在800 bp處見電泳條帶。PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行雙向測序。采用CLC Free Workbench4.5.1軟件對HP菌株測序結(jié)果與GenBank中收錄的HP敏感菌株U27270的23S rRNA基因序列進(jìn)行比對。

2 結(jié)果

2.1 HP菌株耐藥情況 藥敏試驗結(jié)果顯示，49株HP菌株對阿莫西林耐藥8株(16.3%)，對甲硝唑耐藥24株(49.0%)，對克拉霉素耐藥18株(36.7%)，對左氧氟沙星耐藥13株(26.5%)，對四環(huán)素耐藥7株(14.3%)。此外，還存在聯(lián)合耐藥菌株，其中對阿莫西林與克拉霉素聯(lián)合用藥的耐藥率為11.1%(1/49)，對阿莫西林與甲硝唑聯(lián)合用藥的耐藥率為8.2%(4/49)，對阿莫西林與左氧氟沙星聯(lián)合用藥的耐藥率為4.1%(2/49)，對阿莫西林與四環(huán)素聯(lián)合用藥的耐藥率為0。分離出的7株四環(huán)素耐藥菌株均同時對克拉霉素耐藥。

2.2 克拉霉素耐藥HP菌株23S rRNA基因V區(qū)突變情況 18株克拉霉素耐藥HP菌株23S rRNA V 區(qū)存在點突變，突變位點包括A2144G(4/18)、T2183C(15/18)、C2196T(1/18)、A2224G(1/18)、T2245C(18/18)、T2277C(1/18)、A2303G(2/18)、T2321C(1/18)、C2423T(1/18)、G2309A(1/18)、C2750T(1/18)、C2760T(1/18)、T2712C(1/18)、C2695A(1/18)。

3 討論

近年來，HP根除率不斷下降，甚至已低于80%，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的主要原因是耐藥[5]?？死顾厥桥R床最常用的根除HP的藥物之一，HP克拉霉素耐藥率在不同國家和地區(qū)有一定差異，在一些發(fā)達(dá)地區(qū)耐藥率較高[6]。歐洲一項多中心研究表明，兒童HP克拉霉素的耐藥率從1990～1995 年的6.2%上升至2007～ 2009年的19.4%[7]。歐洲Maastricht-Ⅳ 共識會議提出 ，HP克拉霉素耐藥率超過20%時臨床需根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選擇治療藥物[8]。本研究HP克拉霉素耐藥率為36.7%，提示對這類兒童行HP根除治療時應(yīng)行藥物敏感試驗。HP對甲硝唑耐藥是目前全球性問題,嚴(yán)重影響HP根除率。甲硝唑高耐藥率發(fā)生的主要原因為甲硝唑在大多數(shù)感染中被普遍使用；藥物使用劑量不正確；藥物本身的藥理作用和不良反應(yīng)。胡華建等[9]報道，浙江兒童HP甲硝唑耐藥率達(dá)51.8%。本研究為49%，處于較高水平，與以上結(jié)果有一致性。阿莫西林是β-內(nèi)酰胺類抗生素，清除HP效果較好，臨床應(yīng)用較多[10]。以往研究對HP行耐藥性檢測時并沒有檢測到β-內(nèi)酰胺酶活性，說明HP菌株對阿莫西林耐藥的產(chǎn)生與β-內(nèi)酰胺酶的關(guān)系不大[11]。本研究阿莫西林的耐藥率為16.3%，與本地區(qū)成人相近[12]，耐藥率也偏高；需引起臨床重視。左氧氟沙星屬于喹諾酮類抗生素，本研究左氧氟沙星耐藥率為26.5%，高于一般水平?？赡芘c樣本量較小有關(guān)，亦可能與左氧氟沙星在其他疾病中廣泛應(yīng)用有關(guān)，需擴大樣本量進(jìn)一步觀察。四環(huán)素是一類治療HP感染價格較為偏宜的藥物。2000年巴西HP四環(huán)素耐藥率為7%。由于我國使用四環(huán)素類藥物行抗菌治療的時間較長，故HP耐藥率明顯高于其他國家，已達(dá)到58.8%，MIC小于16 mg/L[13，14]。本研究HP對四環(huán)素的耐藥率為14.3%，明顯低于成人，可能與其近20年來四環(huán)素未在兒童中使用有關(guān)。目前兒科根除HP的主要藥物為克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑。克拉霉素是一線藥物，但隨著耐藥菌株的出現(xiàn)，兒童HP感染根除率降低。HP對克拉霉素產(chǎn)生耐藥的機制為HP菌的23S rRNA基因V區(qū)上發(fā)生點突變，導(dǎo)致核糖體的構(gòu)象發(fā)生改變，使克拉霉素結(jié)合位點也隨之改變，進(jìn)而導(dǎo)致HP與克拉霉素的親合力降低，藥物不能有效阻止細(xì)菌蛋白合成[15]。目前不同國家和地區(qū)HP克拉霉素耐藥率均呈逐年上升趨勢。國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報道，國內(nèi)HP克拉霉素耐藥率較高，且逐年上升[16]。而伊朗、埃及開羅的HP克拉霉素耐藥率分別為33.7%、57.7%[17,18]。本研究為36.7%。分析以上數(shù)據(jù)，HP對克拉霉素耐藥率較高，在選用含克拉霉素的三聯(lián)療法作為行根除HP治療時需了解菌株的藥物敏感性。

研究證實，HP菌株23S rRNA基因V區(qū)點突變與克拉霉素耐藥有關(guān)，最普遍的突變位點為A2143G(A2143C)和A2142G。本研究結(jié)果所測菌株中普遍存在T2183C、T2245C突變，突變率分別為85.2%和100%。C2214T位點只在1株山西HP耐藥菌株中發(fā)現(xiàn)[19]；2株HP質(zhì)控菌株NCTC11637和SS1在T2245C、T2321C、T2712C均發(fā)生突變，以上突變位點與HP克拉霉素耐藥并無明顯關(guān)系。本研究A2144G突變率為22%，無法確定A2144G是否與克拉霉素耐藥有關(guān)，需要進(jìn)一步加大樣本量分析。突變位點A2303G、G2309A、G2305A、C2423T、C2750T、C2760T、C2769A國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)未見報道，其中G2305A在9株敏感菌株檢測到1株，C2760T在18株耐藥菌株和9株敏感菌株分別檢測到2株和3株，在耐藥菌株中C2423T、A2303G、G2309A、C2750T、C2769A均僅檢測到1株，以上這些突變位點是否與HP克拉霉素耐藥性有關(guān)，還需加大樣本量進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果提示，貴陽地區(qū)胃部疾病患兒HP菌株23S rRNA基因V區(qū)堿基分布具有較為復(fù)雜的多態(tài)性。

綜上所述，貴陽地區(qū)胃部疾病患兒HP對克拉霉素、甲硝唑的耐藥率較高，對阿莫西林和四環(huán)素耐藥性較低?？死顾啬退嶩P菌株23S rRNA基因V區(qū)存在點突變，最常見的突變位點是T2183C。

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