張 濤 王旭蘭 李秀紅 李向陽 從國彬

(商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 商丘 476000)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CAHD)患者發(fā)病率和致死率極高，老年CAHD患者冠狀動脈血管鈣化嚴(yán)重，冠脈介入手術(shù)難度大，且大多數(shù)老年患者對手術(shù)持排斥態(tài)度，更希望藥物保守治療〔1～6〕。高密度脂蛋白(HDL)因其可逆向轉(zhuǎn)運膽固醇而稱作“血管清道夫”，HDL的血漿含量與心血管事件的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)〔7,8〕。然而，大量關(guān)于提升血漿HDL含量的臨床研究發(fā)現(xiàn)，HDL含量的單純提升并沒有減少相關(guān)心血管發(fā)生率，進(jìn)而使研究者更加注重HDL功能學(xué)的改變〔9～14〕。丹參多酚因其具有活血、化瘀、通脈作用而被廣泛應(yīng)用于臨床CAHD穩(wěn)定性心絞痛患者，丹參多酚酸鹽是否會影響HDL功能尚無報道。本研究擬闡明丹參多酚酸鹽發(fā)揮心血管保護作用的分子生物學(xué)機制。

1 資料與方法

1.1研究對象 實驗組為2016年3～12月就診于陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科CAHD患者50例，年齡62～85歲，排除患有高血壓、糖尿病、腎衰竭、嚴(yán)重感染性疾病等疾病的患者。對照組選取來陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院健康體檢的老年志愿者30例，年齡60～ 72歲。本研究已通過陜西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審核，參與者均簽署知情同意書。兩組一般資料見表1。

1.2HDL提取 抽取對照組及實驗組〔入院當(dāng)天及應(yīng)用丹參多酚酸鹽200 mg(上海綠谷制藥有限公司50 mg/支)7 d后〕空腹靜脈血，參考文獻(xiàn)〔15〕，通過速梯度離心提取HDL：空腹靜脈血離心(4℃ 4 000 r/min 10 min)后將血漿移入預(yù)冷的超高速管(38 ml，Beckman coulter公司)并按比例加入1∶500的乙二胺四乙酸(EDTA，134 mmol/L)和1∶10 000的二丁基羥基甲苯(BHT，200 mmol/L)后離心3次(4℃ 50 000 r/min 21 h)。每次離心結(jié)束后，血漿因其各個成分密度差異而分層，用無菌注射器小心吸取HDL并用0.22 μm的濾器(MerkMillipore公司)過濾后用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(BCA Protein Assay Kit，Thermo Scientific 公司)測定其濃度，提取完畢的HDL存放于4℃冰箱備用(可有效儲存3 w)。

1.3HDL抗氧化能力檢測 按照文獻(xiàn)〔16〕報道cell-free法檢測抗氧化能力。將配置好的 CuCl2(21.7 μmol/L，Sigma公司)10 μl加入同等質(zhì)量的實驗組和對照組HDL內(nèi)避光孵育，孵育至30 min時取10 μl配置好的〔雙氯熒光黃乙酸乙酯(DCFH-DA)，Calbiochem公司，2.0 mg/ml〕加入正在孵育CuCl2的HDL內(nèi)繼續(xù)孵育30 min，孵育滿1 h后用酶標(biāo)儀(Spectra Max，Gemini XS；Molecular Devices，美國Molecular Devices)連續(xù)檢測12 h讀取相對熒光強度值(RFU)記錄分析(理論上RFU值越高，抗氧化能力越弱)。

表1 對照組和實驗組一般臨床資料

與對照組比較：1)P<0.05

1.4HDL對內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮(NO)含量的影響 取4代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)種植于24孔板內(nèi)至細(xì)胞鋪滿>95%后進(jìn)行實驗干預(yù)，實驗分為5組：空白組不做任何處理；陽性對照組加入血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)50 ng/ml，對照組加入正常志愿者的HDL 100 μg/ml；實驗組加入CAHD患者的HDL 100 μg/ml，丹參多酚組加入用丹參多酚酸鹽1 w后的HDL 100 μg/ml。孵育30 min后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，加入二氨基苯甲酸乙酯(DAF-2DA，10 μmol/L，Calbiochem)再次孵育30 min后使用熒光顯微鏡拍照(激發(fā)波長495 nm，發(fā)射515 nm)并記錄。

1.5HDL對內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)源性NO合酶(eNOS)及其磷酸化位點Ser1177的影響 取4代HUVECs種植于6孔板內(nèi)至細(xì)胞鋪滿>95%后進(jìn)行實驗干預(yù)，實驗分為3組：空白組不做任何處理；對照組加入正常志愿者的HDL 100 μg/ml；實驗組加入CAHD患者的HDL 100 μg/ml。孵育1 h后提取內(nèi)皮細(xì)胞蛋白，通過Western印跡法檢測各組HDL對eNOS蛋白及其磷酸化位點Ser1177影響的差異。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 用Graph pad prism5作圖，采用SPSS11.0軟件進(jìn)行t檢驗及F分析。

2 結(jié) 果

2.1實驗組、對照組和丹參多酚組HDL抗氧化能力 與對照組HDL(RFU值為380.2±51.66)比較，實驗組HDL抗氧化能力明顯減弱(RFU值為1 000.12±100.65，P<0.05)，丹參多酚組(RFU值為752.64±60.74)與對照組、實驗組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.25組HDL對內(nèi)皮細(xì)胞NO含量影響 與空白組比較，陽性對照組和對照組明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生成NO，實驗組促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生成NO的能力明顯減弱，丹參多酚組一定程度改善HDL生成NO的能力。見圖1。

圖1 各組HDL對內(nèi)皮細(xì)胞生成NO的影響(×40)

2.3各組HDL對內(nèi)皮細(xì)胞eNOS蛋白活化的影響 與空白組比較，對照組HDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS蛋白的活化；實驗組HDL抑制內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS蛋白的活化。丹參多酚酸鹽的應(yīng)用可以部分恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS蛋白的活化。見圖2和表2。

圖2 各組HDL對內(nèi)皮細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)變化的影響

表2 各組HDL對內(nèi)皮細(xì)胞eNOS蛋白活化的比較

1)與空白組比較；2)與對照組比較；3)與實驗組比較：均P<0.05

3 討 論

本研究結(jié)果闡明了丹參多酚酸鹽在老年CAHD患者中發(fā)揮心血管保護功的分子生物學(xué)機制。CAHD所致心肌缺血有高致死性，尤其在老年患者中，因其冠狀動脈血管鈣化嚴(yán)重，且老年患者機體各個器官均處于終末期，其危險性不言而喻。然而目前臨床上仍缺乏有效改善心肌缺血的方法。血管舒張功能受損被認(rèn)為是冠心病的早期變化，而研究發(fā)現(xiàn)NO和eNOS在此過程中發(fā)揮了重要作用〔5〕。既往研究〔17〕表明：正常人的HDL通過活化eNOS信號通路，進(jìn)而釋放NO而促進(jìn)血管舒張。研究發(fā)現(xiàn)〔18，19〕：正常人的HDL通過 PI3K/Akt和與細(xì)胞增殖緊密相關(guān)的蛋白激酶(RAS)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路參與血管新生。研究顯示疾病狀態(tài)下的HDL無論是結(jié)構(gòu)還是功能上與正常HDL均存在差異：CAHD患者HDL抗氧化能力減弱〔20〕；CAHD患者HDL喪失了活化Akt/eNOS等信號通路的能力〔21〕。李紅文等〔22〕研究顯示：CAHD患者HDL促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移的能力明顯減弱。

研究發(fā)現(xiàn)〔23〕：丹參多酚可以降低人為冠狀動脈結(jié)扎導(dǎo)致的犬急性心肌梗死的心電圖ST段抬高程度、減少心肌梗死的面積、降低血清中低密度脂蛋白含量、部分抑制二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集作用。本文結(jié)果說明丹參多酚酸鹽可以部分修復(fù)CAHD患者HDL的心血管保護作用。

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