趙 濤 劉家驥

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院泌尿外科，重慶 402160)

微小RNA(miR)和老年前列腺癌有密切關(guān)系，參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展〔1～3〕。李明等〔1〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-183在老年前列腺癌中的表達(dá)水平顯著增高，且其增高水平與Gleason評(píng)分呈正相關(guān)關(guān)系〔4〕。但是關(guān)于miR-183在此方面的研究較少。本實(shí)驗(yàn)擬分析miR-183在老年前列腺癌中的表達(dá)狀態(tài)及靶基因促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體(EPH)A4對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1材料和試劑 由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院提供經(jīng)手術(shù)切除保留的12對(duì)老年前列腺癌組織和癌旁組織，切片均經(jīng)過(guò)病理學(xué)鑒定。miR-183 mimics、miR-183、抗鏈球菌溶血素(AS)O、siRNA EPHA4購(gòu)自上海吉瑪技術(shù)制藥有限公司。兔抗人EPHA4、羊抗兔二抗及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購(gòu)自中美合資博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將老年前列腺癌細(xì)胞系PC3和LNCaP置于RPMI1064培養(yǎng)基及37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞每2～3 d換液或傳代1次。在轉(zhuǎn)染前24 h將對(duì)數(shù)期的細(xì)胞PC3和LNCaP接種到合適的孔板，并使其處于正常生長(zhǎng)培養(yǎng)狀態(tài)(37℃、5%CO2)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。同時(shí)設(shè)立對(duì)照組。

1.2.2RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR) 按照Trizol中的步驟提取PC3和LNCaP細(xì)胞中的總RNA，對(duì)RNA OD260和OD280使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算其濃度。用特異的miR-183引物進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)，同時(shí)以U6作為內(nèi)參；OligodT作為通用引物進(jìn)行基因EPHA4的RT，同時(shí)以β-actin作為內(nèi)參。RT-PCR反應(yīng)體系：cDNA 1 μl、引物各1 μl，2×SYBR Green Master Mix 10 μl，無(wú)菌蒸餾水7 μl。反應(yīng)程序的設(shè)置如下：變性(95℃ 3 min)，然后95℃ 15 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.2.3細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞進(jìn)行消化收集后，重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基，種到Transwell的底部具有完全培養(yǎng)基小室內(nèi)(3×104細(xì)胞/孔)。24 h后，將上層小室取出并穩(wěn)固10 min后磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，選用結(jié)晶紫最后染色30 min，然后PBS沖洗，將小室內(nèi)的細(xì)胞用棉簽擦掉。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：將100 μl Matrigel(終濃度為1 mg/ml)加入Transwell上層小室內(nèi)，以垂直的方式，37℃培養(yǎng)4～5 h使其干成膠狀。其他步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.4miR-183基因的生物學(xué)預(yù)測(cè)方法 使用TargegtScan和miRanda網(wǎng)站對(duì)miR-183的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)合靶基因的選取的原則，將EPHA4作為候選靶基因。

1.2.5綠色熒光蛋白(GFP)熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-183 mimics、miR-183 ASO和含有EPHA4 3′UTR、EPHA4 3′UTR mut的熒光報(bào)告載體及對(duì)照質(zhì)粒。48 h后，用1倍PBS清洗，然后通過(guò)RIPA裂解液將細(xì)胞裂解，再來(lái)提取其內(nèi)的蛋白。最后以RFP作為內(nèi)參用測(cè)熒光的儀器測(cè)量熒光值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-183和EPHA4 mRNA在老年前列腺癌和癌旁組織中的表達(dá) miR-183、EPHA4 mRNA在老年前列腺癌組織中的表達(dá)(4.72±0.28，3.22±0.18)顯著高于癌旁組織(1.00±0.18，1.00±0.10，P<0.01)。

2.2miR-183對(duì)老年前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響 遷移結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-183 ASO組PC3、LNCaP細(xì)胞穿膜數(shù)目〔(77.3±8.3)個(gè)、(62.4±6.9)個(gè)〕顯著低于對(duì)照組〔(164.5±10.8)個(gè)、(141.2±11.5)個(gè)〕。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PC3、LNCaP細(xì)胞穿透膜的數(shù)目〔(67.3±9.6)個(gè)、(55.1±8.3)個(gè)〕明顯少于對(duì)照組〔(157.9±12.7)個(gè)、(147.8±11.2)個(gè)，均P<0.01〕，見(jiàn)圖1。

圖1 miR-183在PC3和LNCaP細(xì)胞侵襲和遷移中的作用情況(×200)

2.3miR-183基因的生物學(xué)方法預(yù)測(cè)及對(duì)其靶基因的驗(yàn)證 圖2顯示在EPHA4的3′UTR上含有miR-183的結(jié)合位點(diǎn)。含EPHA4 3′UTR的熒光報(bào)告載體的熒光值通過(guò)miR-183過(guò)表達(dá)后增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染 miR-183 ASO后含有EPHA43′UTR的熒光報(bào)告載體的熒光值減弱(P<0.01)；而將結(jié)合位點(diǎn)突變后，無(wú)論是過(guò)表達(dá)miR-183還是miR-183表達(dá)抑制對(duì)突變的報(bào)告載體的熒光值沒(méi)有影響，見(jiàn)圖3。RT-PCR結(jié)果顯示在PC3和LNCaP細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)miR-183、EPHA4 mRNA水平升高，轉(zhuǎn)染miR-183 ASO后，EPHA4 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

圖2 miR-183和EPHA4的結(jié)合位點(diǎn)及EPHA4突變的結(jié)合位點(diǎn)

圖3 GFP熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 RT-PCR結(jié)果

3 討 論

miRNA是比較保守的、內(nèi)源性表達(dá)的小分子非編碼RNA，廣泛參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡甚至腫瘤的發(fā)生等細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程，在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用〔5〕。有研究顯示miR-183在老年前列腺癌中的含量升高〔1～3〕。有研究利用組織芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-183在老年前列腺癌中是增高的，且發(fā)現(xiàn)隨著Gleason評(píng)分升高，miR-183表達(dá)水平也增高，而與在良性前列腺增生癥(BPH)的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs let-7d，let-7g，miR-98，miR-96和miR-183的表達(dá)譜在一定水平上可以作為老年前列腺癌行為改變?cè)谏飳W(xué)上的反應(yīng)，可用于作為早期檢測(cè)的標(biāo)志物〔6〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示miR-183在一定程度上可以顯著抑制老年前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

EPHA4是最大的受體酪氨酸激酶家族EPH的成員之一，EPH受體家族參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、信號(hào)傳導(dǎo)、代謝及凋亡等一系列的生物變化，同時(shí)也參與一些心血管疾病、代謝性疾病及惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，并發(fā)揮著極其有價(jià)值的生物學(xué)功能〔7〕。多項(xiàng)研究表明，EPH受體家族與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系〔8～10〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了miR-183可能通過(guò)靶定EPHA4來(lái)對(duì)老年前列腺癌癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移進(jìn)行調(diào)控。

1李 明，張洪福，曹立宇，等.前列腺癌組織中4種microRNAs的表達(dá)及意義〔J〕.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009；44(4)：443-6.

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4李 明，尹 玉，曹立宇，等.微小RNA在前列腺癌組織中的表達(dá)及意義〔J〕.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2008；17(6)：565-70.

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