段淑香,張洪強,楊永曜,張紅明,徐慶國

(1山東省立第三醫(yī)院，濟南250000；2濟南軍區(qū)總醫(yī)院；3貴州省人民醫(yī)院)

冠狀動脈痙攣(CAS)是指心外膜下傳導動脈發(fā)生一過性收縮，引起血管部分或完全閉塞，導致心肌缺血的一組臨床綜合征。CAS是構成多種心臟缺血性疾病的基本病因，包括變異型心絞痛、不穩(wěn)定型心絞痛、猝死等[1]。目前CAS的確切發(fā)生機制不明確，推測可能與血管內皮功能障礙、氧化應激、血管平滑肌細胞高反應性以及血管收縮和舒張物質的失衡有關[2]。抵抗素樣分子(RELMɑ)是脂肪組織分泌具有生物活性的蛋白質，有促進血收縮管、血管新生的作用。前期研究中，我們已證實RELMɑ在動脈粥樣硬化斑塊中強烈表達[3]，同時發(fā)現(xiàn)其也是血管生成的開關基因[4]。2016年8月～2017年3月，我們就RELMα信號轉導通路對動脈粥樣硬化中血管收縮動態(tài)平衡的影響進行了研究，以尋找CAS防治的新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠由山東大學實驗動物中心提供；大鼠主動脈平滑肌細胞(RASMC)購自Scien Cell公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；重組RELMα蛋白購自美國Prospec公司；兔源單克隆抗大鼠鈣調素(CaM)、肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)抗體購自美國Abcam公司；CaM抑制劑W-7、MLCK抑制劑ML-7均購自美國Sigma公司；HRP標記的羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司。

1.2 大鼠血管環(huán)張力測定 取SD大鼠10只用10%水合氯醛麻醉，處死后打開胸腔，游離胸主動脈，置于4 ℃含95%O2和5%CO2混合氣體預飽和的K-H液中，小心剔除胸主動脈周圍結締組織，剪成3～4 mm的血管環(huán)(去內皮血管環(huán))。選取反應良好的血管環(huán)，利用Powerlab四道生理儀記錄其張力變化。血管環(huán)穩(wěn)定后，用移液器吸取RELMα、AngⅡ、MLCK抑制劑或者等量的平衡液分別向浴槽中加入，稀釋后的浴槽濃度即為實驗的終濃度，觀察其對血管的效應。

1.3 RASMC培養(yǎng) RASMC置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用的培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、100 g/L青霉素和100g/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，待細胞長至70%～80%融合時進行藥物干預。采用3～5代細胞進行以下實驗。

1.4 RASMC分組及干預 RASMC在6孔板中培養(yǎng)24 h后隨機分為5組。正常對照組RASMC在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；陽性對照組用終濃度為1×10-7mol/L的AngⅡ刺激細胞48 h；RELMα刺激組：終濃度為4×10-8mol/L的RELMα刺激細胞48 h；RELMα+CaM抑制劑組：RELMα+W-7刺激細胞48 h；RELMα+ MLCK抑制劑組：RELMα+ML-7刺激細胞48h。

1.5 RASMC內CaM和MLCK蛋白表達檢測 采用Western blotting法。提取各組RASMC總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠分離蛋白后，轉移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，加入一抗4 ℃孵育過夜：抗CaM一抗(稀釋度1∶1 000)，抗MLCK一抗(稀釋度1∶3 000)，抗β-actin(濃度1∶1 000)。次日將膜取出，TBST洗脫3次，孵育二抗(濃度為1∶10 000)置于室溫1.5 h。根據(jù)ECL試劑盒說明書操作發(fā)光自顯影，拍照并用隨機軟件分析條帶光密度。β-actin作為內參照物，通過計算CaM/β-actin、MLCK/β-actin的光密度比值求得各組CaM、MLCK蛋白表達。

2 結果

2.1 不同處理方式大鼠胸主動脈血管環(huán)張力變化 血管環(huán)在加入RELMα后2 min左右血管張力開始升高，10 min左右達到平臺期；加入MLCK抑制劑，再加入RELMα后血管環(huán)張力無明顯升高。加入等量平衡液、AngⅡ、RELMα、RELMα+MLCK處理血管環(huán)后，血管張力分別為7.27%±2.23%、59.97%±5.56%、85.07%±3.06%、11.02%±2.41%。與加入等量平衡液、AngⅡ比較，加入RELMα后血管張力升高；再加入ML-7后血管張力下降，且低于AngⅡ，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

2.2 各組RASMC內CaM蛋白表達 正常對照組、陽性對照組、RELMα刺激組、RELMα+CaM抑制劑組CaM蛋白表達分別為0.24±0.08、0.62±0.20、1.41±0.33、0.45±0.33。RELMα刺激后能明顯增加CaM蛋白表達，RELMα刺激組CaM蛋白高于正常對照組和陽性對照組(P均<0.05)；加用CaM抑制劑W-7后，RASMC內CaM蛋白表達降低(P<0.05)，但其表達量仍高于正常對照組(P<0.05)。

2.3 各組RASMC內MLCK蛋白表達 正常對照組、陽性對照組、RELMα刺激組、RELMα+MLCK抑制劑組蛋白表達分別為0.23±0.15、0.60±0.27、1.29±0.30、0.24±0.15。RELMα可刺激RASMC內MLCK蛋白的表達增加，RELMα刺激組MLCK蛋白表達高于正常對照組和陽性對照組(P均<0.05)；加用MLCK抑制劑ML-7， RASMC內MLCK蛋白表達降低(P<0.05)，RELMα+MLCK抑制劑組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

RELMα作為一種脂肪細胞因子，在正常組織中表達較少，在肺動脈高壓及動脈粥樣硬化模型中表達升高。RELMα除具有強大的收縮血管的作用外，還有促進血管新生、增殖的作用。目前， RELMɑ在呼吸系統(tǒng)疾病中的研究較多，主要為該因子在肺動脈高壓、肺纖維化、支氣管哮喘、肺發(fā)育和代償性增生等過程中的作用[5～7]。RELMɑ在心血管疾病方面的研究多為體外實驗，RELMɑ與動脈粥樣硬化進展中血管收縮與冠脈血管穩(wěn)定性關系的報道甚少。本課題組在ApoE基因敲除的鼠動脈粥樣硬化斑塊內進行RELMɑ的RT-PCR檢測和免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，對比野生C57/BL小鼠，在動脈粥樣硬化模型粥樣斑塊內明顯可見RELMɑ陽性顆粒及其mRNA表達，從而證實RELMɑ在鼠動脈粥樣硬化斑塊內存在[3]。Teng等[8]研究表明，在缺氧的條件下肺動脈壁內RELMα表達明顯上調；而在動脈粥樣硬化的動脈壁內也存在缺氧，RELMα表達亦明顯上調，因此研究RELMα對RASMC的收縮功能，對預防CAS患者血管痙攣、斑塊破裂具有重要的臨床意義。

本研究采用離體灌流血管環(huán)的方法觀察了RELMα收縮血管的作用并與AngⅡ作對比，發(fā)現(xiàn)RELMα可引起血管收縮，其作用強于ANGⅡ，加用MLCK抑制劑后，RELMα收縮血管的作用減弱。肌球蛋白輕鏈(MLC)磷酸化是血管平滑肌收縮的最重要步驟之一，MLCK使MLC磷酸化，肌球蛋白磷酸化酶也使MLC磷酸化，兩種機制共同調節(jié)MLC的磷酸化水平[9]。血管收縮因子與VSMC表面相應受體結合，激活磷脂酶C(PLC)，通過不同途徑激活MLCK亞單位，磷酸化MLC，使VSMC產生收縮和高反應性。研究證實，RELMα刺激人類肺動脈血管平滑肌細胞后，可引起細胞內鈣離子濃度升高，并進一步證實此過程是通過PLC-IP3途徑實現(xiàn)的[10]。Chen等[11]研究提示，F(xiàn)IZZ1可通過上調MLCK、MLC-20的表達水平增強其對氣道平滑肌的收縮反應；FIZZ1處理氣道后可引起氣管上皮的損傷，并激活c-Raf-ERK1/2-p38MAPK信號轉導通路收縮氣道平滑肌。

為進一步探討RELMα引起大鼠主動脈血管平滑肌細胞收縮的機制，本文對血管收縮信號轉導通路相關蛋白的變化進行了研究。顯示RELMα刺激后大鼠主動脈平滑肌細胞內CaM、MLCK蛋白表達增加，較正常對照組和ANGⅡ刺激組均升高；加入MLCK抑制劑后，RELMα刺激引起大鼠主動脈平滑肌細胞內MLCK蛋白表達不在增高；而加入CaM抑制劑后，RELMα刺激不會引起大鼠主動脈平滑肌細胞內CaM蛋白表達降低的明顯升高，但仍高于正常對照組。提示RELMα對大鼠主動脈平滑肌細胞的收縮作用可通過Ca2+-CaM-MLCK途徑實現(xiàn)，但不是唯一途徑。

綜上所述， RELMα可通過Ca2+-CaM-MLCK途徑引起血管平滑肌收縮，此作用可能在CAS患者血管痙攣的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。