裴瑋娜，呼海娟，劉凡，魯靜朝，楊秀春，崔煒

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院·河北省心腦血管病研究所，石家莊050000)

C反應(yīng)蛋白(CRP)是一種由肝臟合成的急性時相蛋白，是預(yù)測未來心血管事件的獨立危險因素[1, 2]，而且病理水平的CRP可能直接參與了動脈粥樣硬化的形成、演變以及缺血再灌注損傷的過程[3]。然而，CRP是否能夠直接加重心肌缺血再灌注損傷這一過程及其發(fā)生機制目前尚不十分明確。2015年3月～2016年3月，我們采用乳鼠原代培養(yǎng)的心肌細胞建立氧糖剝奪再灌注模型，探討CRP作為刺激因子對心肌缺血再灌注損傷的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人重組CRP 購自于Calbiochem公司，Ⅱ型膠原酶購自于美國Gibco公司，二氮嗪(DZ)和環(huán)孢素A (CsA)均購自于Sigma公司，乳酸脫氫酶(LDH)漏出檢測試劑盒由中國南京市建城生物工程研究所提供。鱟試劑內(nèi)毒素去除試劑盒購自廈門鱟試劑生物科技股份有限公司。CRP制劑去除內(nèi)毒素，經(jīng)純化后由鱟試劑測定CRP中內(nèi)毒素濃度<0.1 EU/mL。

1.2 細胞培養(yǎng) 取出生1～2 d的新生SD大鼠心室心肌細胞,應(yīng)用胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶消化，然后用包含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。心肌細胞以1×105/mL的密度接種于96孔板上，置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，其中培養(yǎng)48 h后更換細胞培養(yǎng)液。在培養(yǎng)基中加入5-溴-2'-脫氧尿苷以抑制成纖維細胞的附著和增殖。利用抗α-肌動蛋白免疫組化法鑒定心肌細胞，培養(yǎng)細胞中95%以上為心肌細胞。

1.3 氧糖剝奪再灌注模型 (OGD/R)建立 原代培養(yǎng)的心肌細胞經(jīng)過不同處理方案后進行氧糖剝奪3 h，再灌注1 h。將加入了無糖DMEM培養(yǎng)液心肌細胞置于三氣培養(yǎng)箱內(nèi)(5%CO2和95% N2，37℃)培養(yǎng)3 h。再灌注時，則將無糖DMEM培養(yǎng)基更換為高糖DMEM培養(yǎng)基，并置于5%CO2培養(yǎng)箱中(21%O2和5%CO2)37℃孵育1 h，以此來模擬體內(nèi)的缺血再灌注過程。

1.4 細胞分組 原代培養(yǎng)的新生SD大鼠心肌細胞隨機分為以下5組。①對照組：沒有經(jīng)過OGD/R的正常培養(yǎng)組。②OGD/R組：培養(yǎng)后建立OGD/R；③CRP+OGD/R組：進行OGD/R之前，應(yīng)用10 μg/mL的CRP與心肌細胞共同孵育24 h；④CRP+CsA+OGD/R組：心肌細胞先與CRP共同孵育24 h，然后進行3 h的氧糖剝奪。在再灌注開始時加入10 μmol的CsA與心肌細胞孵育20 min；⑤CRP+DZ+OGD/R組：心肌細胞先與CRP共同孵育24 h，在進行OGD/R前，加入100 μmol的二氮嗪共同孵育90 min，再進行OGD/R。

1.5 心肌細胞活力測定 采用MTS法測定心肌細胞活力。各組樣品37 ℃避光培養(yǎng)1 h，使用酶標儀在490 nm處檢測各孔吸光度(OD)值，以O(shè)D值間接反映心肌細胞活力。

1.6 心肌細胞培養(yǎng)液LDH水平檢測 實驗結(jié)束時留取各組心肌細胞培養(yǎng)液，以1 000 r/min 離心1 min后取上清液，標本置于-80 ℃低溫冰箱保存、備用。通過檢測從質(zhì)膜破裂細胞中釋放到培養(yǎng)液中的LDH水平，判斷細胞壞死程度。

1.7 線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開放水平測定 采用calcein/AM免疫熒光法。選擇復(fù)氧后20 min測定心肌細胞的綠色熒光強度，設(shè)定激發(fā)光為488 nm，檢測光為505nm，通過Image J軟件分析綠色熒光強度，以此確定mPTP開放水平。綠色熒光強度的變化與mPTP開放程度呈反比。

1.8 線粒體膜電位水平測定 采用四甲基羅丹明乙酯(TMRE)免疫熒光法。設(shè)定激發(fā)光為543 nm，檢測光為580 nm，通過Image J軟件分析紅色熒光強度，以此確定線粒體膜電位水平。紅色熒光強度與線粒體膜電位水平呈正比。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細胞活力比較 以對照組心肌細胞活力為100%，其他各組心肌細胞活力以占對照組數(shù)值的百分比表示。OGD/R組、CRP+OGD/R組、CRP+CsA+OGD/R組、CRP+DZ+OGD/R組心肌細胞活力分別為82.36%±6.18%、64.84%±4.06%、91.30%±5.18%、92.63%±5.74%。經(jīng)過OGD/R處理后，心肌細胞活力下降；CRP預(yù)處理組可進一步降低心肌細胞活力；給予CsA或DZ預(yù)處理后心肌細胞活力增高；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05) 。

2.2 各組心肌細胞培養(yǎng)液LDH水平比較 對照組、OGD/R組、CRP+OGD/R組、CRP+CsA+OGD/R組、CRP+DZ+OGD/R組心肌細胞培養(yǎng)液LDH水平分別為(95.10±21.57)、(145.30±16.06)、(208.20±19.23)、(92.72±17.56)、(93.37±23.99)U/L。與對照組比較，OGD/R組心肌細胞培養(yǎng)液LDH水平上升；給予CRP預(yù)處理后，LDH水平進一步升高；預(yù)先給予CsA或DZ處理均能夠降低LDH水平；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

2.3 各組mPTP開放水平比較 以對照組mPTP綠色熒光強度為100%，各組與對照組比較進行標準化處理。OGD/R組、CRP+OGD/R組、CRP+CsA+OGD/R組、CRP+DZ+OGD/R組mPTP綠色熒光強度分別為60.93%±2.82%、33.08%±3.48%、85.09%±4.11%、81.17%±4.13%。與對照組相比，OGD/R組心肌細胞mPTP開放水平升高；給予CRP干預(yù)mPTP開放水平進一步升高；預(yù)先給予CsA或DZ處理mPTP開放水平降低；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

2.4 各組線粒體膜電位水平比較 以對照組粒體膜電位紅色熒光強度為100%，各組與對照組比較進行標準化處理。OGD/R組、CRP+OGD/R組、CRP+CsA+OGD/R組、CRP+DZ+OGD/R組線粒體膜電位紅色熒光強度分別為57.26%±2.95%、33.31%±2.03%、77.35%±2.38%、72.26%±2.45%。與對照組比較，OGD/R組線粒體膜電位水平降低；給予CRP干預(yù)膜電位水平進一步下降；預(yù)先給予CsA或DZ處理膜電位水平升高；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

3 討論

目前，再灌注治療已經(jīng)成為缺血性心臟病的重要治療手段。然而再灌注的同時會導(dǎo)致細胞損傷及心臟功能障礙，即形成心肌缺血再灌注損傷(MIRI)[4]。建立心肌細胞缺血再灌注損傷模型，對于在細胞層面研究這一病生理過程意義重大。為此，本研究通過原代培養(yǎng)SD大鼠心肌細胞并建立OGD/R模型來模擬體內(nèi)的心肌缺血再灌注損傷的病理過程。

CRP不僅僅是急性期時相的一種炎癥標記物，而且與動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系，CRP可以預(yù)測冠心病患者日后發(fā)生心血管事件的風險[5～8]。Paul等[9]研究證實，人類CRP轉(zhuǎn)基因表達加速了缺乏載脂蛋白E的小鼠主動脈粥樣硬化的進程。Verma等[10]研究表明，CRP可以促進內(nèi)皮細胞的活化、加重功能障礙，誘導(dǎo)了細胞凋亡蛋白酶介導(dǎo)的人類冠狀動脈血管平滑肌細胞的凋亡，從而加重了心肌梗死和動脈粥樣硬化血栓的形成。此外，他們還發(fā)現(xiàn)這些影響與CRP中的疊氮化鈉或內(nèi)毒素無關(guān)。研究認為，CRP的作用機制包括補體的激活、血管壁損傷、血栓形成狀態(tài)、內(nèi)皮功能障礙以及氧化低密度脂蛋白的調(diào)節(jié)作用等[11]。另有報道顯示，CRP檢測對原發(fā)性心血管疾病預(yù)防及心力衰竭、房顫和冠狀動脈支架血栓形成或再狹窄的預(yù)后判斷有重要作用。此外，已有一些研究探討了CRP對心肌缺血再灌注損傷的影響[12]。

Thiele等[13]認為CRP五聚體的分離，即由五聚體結(jié)構(gòu)分離成單體結(jié)構(gòu)這一過程可以調(diào)節(jié)急性炎癥反應(yīng)(心臟缺血/再灌注)和慢性炎癥過程(動脈粥樣硬化)。一些關(guān)于腸道、腎臟、肝臟等器官的缺血再灌注動物模型的實驗研究顯示加入CRP干預(yù)后可以增加組織損傷[14,15]。本研究顯示，在OGD/R前給予CRP干預(yù)24 h能夠明顯降低心肌細胞活力，并升高LDH濃度水平。提示CRP直接加重了OGD/R損傷，此為臨床減少再灌注損傷提供了新的治療靶點。

心肌缺血再灌注損傷與線粒體ATP敏感性鉀通道(mitoKATP)的抑制和mPTP通道的開放息息相關(guān)。越來越多的證據(jù)表明，作為一種位于線粒體內(nèi)膜中的非選擇性高電導(dǎo)通道，mPTP的開放介導(dǎo)了缺血再灌注損傷早期的細胞凋亡。在缺血發(fā)生時，mPTP處于關(guān)閉狀態(tài)。再灌注開始后，線粒體Ca2+濃度明顯增高，并且活性氧簇(ROS)生成增加，引起mPTP開放，繼而產(chǎn)生一系列的病理過程，導(dǎo)致心肌細胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，mitoKATP在缺血預(yù)處理心肌保護中有重要作用。在缺血過程中，mitoKATP通道的開放會導(dǎo)致線粒體膜的去極化，線粒體膜電位的降低，從而導(dǎo)致蛋白激酶C活化，抑制ROS的生成，進而抑制細胞的凋亡。DZ是一種選擇性的mitoKATP通道開放劑，它通過保護線粒體完整性和抑制細胞凋亡來減少線粒體損傷。CsA是一種mPTP的抑制劑，已經(jīng)被證實其可以減少心肌梗死面積，維持心臟功能。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，OGD/R組心肌細胞mPTP開放升高、線粒體膜電位水平降低；給予CRP干預(yù)mPTP開放水平進一步升高、膜電位水平進一步下降；預(yù)先給予CsA或DZ處理mPTP開放降低、膜電位水平升高。同時，各組心肌細胞活力和LDH水平隨mPTP開放水平、線粒體膜電位水平改變發(fā)生相應(yīng)變化，此可能就是CRP加重心肌缺血再灌注損傷的機制。

綜上所述，CRP能夠直接加重心肌缺血再灌注損傷。CRP促進mPTP開放并降低線粒體膜電位可能是其加重心肌缺血再灌注損傷的機制之一。