孫紅麗，楊繼輝，牛楠，朱明星，趙巍，宋熔

(1寧夏醫(yī)科大學，銀川750004；2中國人民解放軍第五醫(yī)院)

心臟對氧氣的需求較為敏感，缺氧會造成心肌細胞不可逆的損傷，因此，提高缺氧條件下心肌細胞的存活能力顯得尤為重要。研究顯示，核呼吸因子-1(NRF-1)可以改善細胞在缺氧條件下的存活能力[1]。NRF-1可以通過與過氧化物酶體增殖受體γ輔激活因子1α(PGC1α)結(jié)合，調(diào)節(jié)線粒體的功能，從而增強細胞呼吸能力及代謝水平[2]。因此，了解缺氧條件下NRF-1對心肌細胞的影響具有重要意義。2015年11月～2016年8月，我們構(gòu)建了NRF-1過表達的大鼠心肌細胞系，觀察缺氧條件下細胞增殖及凋亡水平的變化，為心血管系統(tǒng)疾病的研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠心肌細胞H9C2和293T細胞購自中國科學院上海生命科學研究院，感受態(tài)細胞JM109購自Promega公司。pCDH-Promoter-MCS-EF1-Puro慢病毒載體購自Invitrogen公司，包裝質(zhì)粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)購自SBI公司。TRIzol RNA提取試劑購自Invitrogen公司，限制性核酸內(nèi)切酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ購自Thermo公司，NRF-1兔單克隆抗體購自Abcam公司，鼠抗β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG購自中杉金橋公司，AnnexinⅤ-APC/7-ADD凋亡檢測試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司，PolyJet轉(zhuǎn)染試劑購自SignaGen公司。FACSAriaⅢ流式細胞分選儀購自BD公司，PCR擴增儀購自BIO-RAD公司，CO2培養(yǎng)箱、缺氧用三氣培養(yǎng)箱、超高速離心機購自Thermo公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組處理 向H9C2細胞中加入完全培養(yǎng)液(10%胎牛血清+DMEM高糖培養(yǎng)基+1%雙抗)培養(yǎng)。將細胞分為NRF-1過表達組、空載體組和正常對照組。NRF-1過表達組、空載體組分別用NRF-1過表達慢病毒及空載體病毒進行轉(zhuǎn)染，正常對照組不做處理。將三組細胞置于缺氧用三氣培養(yǎng)箱中進行缺氧培養(yǎng)(37 ℃、1% O2+5% CO2+94% N2)24 h。

1.3 細胞增殖情況觀察 采用實時無標記分析(RTCA)技術(shù)。實驗前校正E-plate8細胞培養(yǎng)板。取三組細胞，制成細胞密度為1×105/mL的單細胞懸液，取300 μL加入E-plate8細胞培養(yǎng)板中。按照RTCA的操作說明監(jiān)測缺氧6、12、24 h時的細胞增殖水平。

1.4 細胞凋亡情況觀察 采用流式細胞儀。取三組缺氧24 h時的細胞，制成細胞密度為3×105/mL的單細胞懸液，4 ℃離心5 min，棄上清，PBS洗滌，加入5 μL Binding buffer重懸細胞，加入5 μL AnnexinⅤ-APC和5 μL 7-ADD染液混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 細胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3) mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。取三組缺氧24 h時的細胞，加入TRIzol液提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，加入caspase-3引物及GAPDH引物進行PCR反應(yīng)。caspase-3上游引物:5′-TGACTGGAAAGCCGAAACT-3′，下游引物5′-GGGTGCGGTAGAGTAAGCAT-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃ 2 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。用2-ΔΔct法計算目的基因相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖水平比較 缺氧6 h時，正常對照組、NRF-1過表達組、空載體組細胞增殖水平分別為1.08±0.02、0.96±0.41、0.81±0.02，組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；缺氧12 h時，正常對照組、NRF-1過表達組、空載體組細胞增殖水平分別為1.07±0.01、1.48±0.12、0.96±0.03，NRF-1過表達組高于正常對照組和空載體組(P均<0.05)；缺氧24 h時，正常對照組、NRF-1過表達組、空載體組細胞增殖水平分別為0.99±0.11、1.00±0.01、0.99±0.01，組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

2.2 各組細胞凋亡率比較 缺氧24 h時，正常對照組、NRF-1過表達組、空載體組細胞凋亡率分別為39.13%±0.59%、17.17%±0.25%、31.50%±0.90%。與正常對照組和空載體組比較，NRF-1過表達組細胞凋亡率均降低(P均<0.05)。

2.3 各組細胞中caspase-3 mRNA表達比較 缺氧24 h時，正常對照組、NRF-1過表達組、空載體組細胞中caspase-3 mRNA的表達水平分別為0.85±0.14、0.48±0.11、0.63±0.08，NRF-1過表達組低于正常對照組(P<0.05)，NRF-1過表達組與空載體組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

各種應(yīng)激造成的心肌細胞損傷是心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生的重要病因，而缺氧造成的心肌細胞凋亡是心肌細胞損傷的重要因素[3]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制心肌細胞凋亡可有效預(yù)防心力衰竭的發(fā)生[4]。因此，尋找能夠抑制缺氧條件下心肌細胞凋亡的方法對研究心血管疾病具有重要意義。目前基因治療已被廣泛應(yīng)用于多種疾病的研究中，尤其在心血管疾病的研究中具有很大的發(fā)展空間。NRF-1最初是在研究線粒體細胞色素C的表達中發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其通過參與線粒體的生物合成、信號轉(zhuǎn)導、氧化應(yīng)激和細胞凋亡等過程來調(diào)節(jié)細胞的生長代謝[5～7]。研究顯示，NRF-1基因敲除鼠在妊娠晚期會造成胚胎致死，表明NRF-1基因在細胞的生長發(fā)育中是必不可少的[8]。

NRF-1在一些應(yīng)激條件下可降低細胞凋亡水平，同時也能提高細胞呼吸能力，增強細胞的存活能力[4]。但在心肌細胞中，尤其在缺氧條件下NRF-1對心肌細胞損傷的影響報道甚少。有研究顯示，在缺血性心臟病、心力衰竭、心律失常等疾病中，NRF-1表達水平下降[9]。本研究結(jié)果顯示，在缺氧條件下，NRF-1過表達組細胞增殖水平較正常對照組和空載體組升高，細胞凋亡水平較正常對照組和空載體組下降，表明NRF-1對缺氧引起的心肌細胞凋亡具有一定的抑制作用。

caspase-3是caspase家族中的成員，正常細胞中caspase-3處于非活化的酶原狀態(tài)，凋亡程序一旦開始，caspase-3由內(nèi)源性(線粒體)或外源性(死亡配體)途徑活化，隨后發(fā)生凋亡蛋白酶的層疊級聯(lián)反應(yīng)，從而發(fā)生不可逆的凋亡[10～12]。有研究報道，心臟在缺血再灌注損傷時caspase-3表達水平升高[13，14]。本研究結(jié)果顯示，在缺氧條件下，NRF-1過表達組caspase-3 mRNA表達水平降低，表明NRF-1可能與缺氧條件下caspase-3活化的凋亡有關(guān)。

綜上所述，NRF-1在心肌細胞的增殖過程中發(fā)揮重要作用,在缺氧條件下NRF-1基因?qū)9C2存活能力具有重要影響，其機制可能是通過抑制細胞凋亡實現(xiàn)的。本研究結(jié)果表明，NRF-1基因在心血管系統(tǒng)疾病中具有重要的作用，為今后心血管系統(tǒng)疾病的基因治療提供了一個候選基因。