張英，韓俊

(江漢大學(xué)附屬醫(yī)院，武漢430015)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種自身免疫性疾病，以慢性進(jìn)展的關(guān)節(jié)滑膜炎癥為特征。它主要引起關(guān)節(jié)疼痛和腫脹，若未積極治療，將最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和殘疾并嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。雷公藤多苷(TwHF)是一種傳統(tǒng)中藥，其可通過(guò)抑制炎性細(xì)胞和炎性因子的產(chǎn)生，從而緩解RA病情。微小RNA(miRNA)是一種內(nèi)源性單鏈小分子RNA。通過(guò)與mRNA結(jié)合抑制翻譯或造成mRNA被酶解、切割而起到基因調(diào)控的作用[2]。有研究表明，miR-146a在RA和其他自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[3，4]。但miR-146a在TwHF治療RA中的作用尚不清楚。本研究通過(guò)觀察RA患者應(yīng)用TwHF治療前后外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中miR-146a表達(dá)的變化，評(píng)價(jià)miR-146a表達(dá)變化與RA患者臨床應(yīng)答的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月～2016年12月在我院就診的中重度活動(dòng)性RA患者62例，男22例、女40例，年齡(45.45±15.91)歲，病程11～27個(gè)月。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2010年ACR/EULAR關(guān)于RA的分類標(biāo)準(zhǔn)；年齡18～65歲；疾病處在中度至重度活動(dòng)性，定義為28關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)度(DAS28)≥3.2分；經(jīng)甲氨蝶呤(MTX)或來(lái)氟米特(LEF)單藥治療效果不佳。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有嚴(yán)重關(guān)節(jié)變形或接受過(guò)關(guān)節(jié)手術(shù)者；6個(gè)月內(nèi)接受過(guò)TwHF、生物制劑或抗風(fēng)濕病情藥物(DMARDs)聯(lián)合治療者；合并肝腎功能嚴(yán)重異常、惡性血液疾病或惡性實(shí)體腫瘤、嚴(yán)重感染者；妊娠或哺乳期婦女；認(rèn)知功能障礙或難以進(jìn)行項(xiàng)目評(píng)估者；因難以耐受治療或治療無(wú)效退出研究者；治療過(guò)程中失訪者。另選擇性別、年齡匹配的60例健康志愿者作為對(duì)照組，男25例、女35例，年齡(43.72±13.84)歲。本研究獲得本院倫理委員會(huì)同意和批準(zhǔn)，所有受試者簽署知情同意書(shū)。

1.2 治療方法 RA患者給予TwHF治療，20 mg/次、3次/d，連續(xù)24周。根據(jù)患者病情，可聯(lián)合MTX或LEF治療。

1.3 療效評(píng)價(jià)方法 在RA患者接受治療的基線期、12周、24周分別評(píng)估DAS28評(píng)分，根據(jù)治療24周后DAS28評(píng)分下降情況，將患者分為臨床應(yīng)答和臨床不應(yīng)答兩個(gè)水平。臨床應(yīng)答參考EULAR標(biāo)準(zhǔn)，定義為治療24周后DAS28評(píng)分下降≥1.2分。

1.4 PBMC中miR-146a表達(dá)檢測(cè) 采集RA患者基線期、12周、24周和對(duì)照組基線期外周血5 mL，EDTA抗凝，密度梯度離心法分離PBMC。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-146a表達(dá)。使用TRIzol RNA分離試劑盒分離總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以U6作為miRNA內(nèi)參，嚴(yán)格按照KAPA SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。引物序列：miR-146a上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGTGAGAACTGAATTCCATG-3′，下游引物5′-TGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-146a的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 RA組和對(duì)照組PBMC中miR-146a表達(dá)比較 RA組和對(duì)照組PBMC中miR-146a的相對(duì)表達(dá)量分別為1.051(0.789，2.243)和2.906(1.860，3.953)，RA組PBMC中miR-146a表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.01)。

2.2 RA患者TwHF治療前后PBMC中miR-146a表達(dá)變化 RA患者基線期、12周、24周時(shí)PBMC中miR-146a相對(duì)表達(dá)量分別為2.906(1.860，3.953)、2.296(1.456，4.183)和1.670(0.664，3.012)，12、24周時(shí)均較基線期下降，24周時(shí)較12周時(shí)下降(P均<0.01)。

2.3 RA患者TwHF治療臨床應(yīng)答和臨床不應(yīng)答者基線miR-146a表達(dá)比較 62例RA患者中，臨床應(yīng)答34例，臨床不應(yīng)答28例，二者基線期的miR-146a相對(duì)表達(dá)量分別為2.386(1.729，3.307)和3.240(2.015，4.174)，臨床應(yīng)答者的基線期miR-146a表達(dá)高于臨床不應(yīng)答者(P<0.05)。

2.4 RA患者TwHF治療臨床應(yīng)答與不應(yīng)答者的臨床指標(biāo)比較 見(jiàn)表1。臨床應(yīng)答者基線期CRP水平高于臨床不應(yīng)答者(P=0.018)。

2.5 RA患者TwHF臨床應(yīng)答的影響因素 將單因素Logistic回歸中P<0.1的因素進(jìn)一步納入多因素Logistic回歸，結(jié)果顯示，miR-146a(P=0.205)和CRP(P=0.155)均與TwHF治療RA的臨床應(yīng)答無(wú)關(guān)。見(jiàn)表2。

表1 RA患者TwHF臨床應(yīng)答和不應(yīng)答者的臨床指標(biāo)比較

表2 影響臨床應(yīng)答因素的多因素Logistic回歸分析

3 討論

miR-146家族主要包括miR-146a和miR-146b基因，兩個(gè)基因分別位于人的第5、10號(hào)染色體，兩者的成熟序列僅相差2個(gè)堿基，這兩個(gè)miRNA在有些細(xì)胞中功能相近，但miR-146a僅在Treg細(xì)胞中高度表達(dá)[5]。研究表明，miR-146a是參與炎性疾病發(fā)病機(jī)制的幾種miRNA之一。穩(wěn)態(tài)的miR-146a表達(dá)對(duì)于Th1細(xì)胞的反應(yīng)及相關(guān)自身免疫性疾病起重要作用。其中，RA作為典型的Th1細(xì)胞反應(yīng)及自身免疫性疾病受到眾多學(xué)者的關(guān)注。大量研究表明，miR-146a可以通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥免疫應(yīng)答來(lái)影響RA的進(jìn)展。miR-146a過(guò)表達(dá)可能會(huì)抑制TRAF6、IRAK1的產(chǎn)生進(jìn)而導(dǎo)致超免疫炎癥反應(yīng)[6]；刺激Th1細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、IL-12和干擾素γ(IFN-γ)來(lái)促進(jìn)RA的炎癥[7]；通過(guò)NF-κB通路，誘導(dǎo)各種促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-17等的分泌[8]；以IL-17為靶向，促進(jìn)T細(xì)胞的產(chǎn)生從而誘導(dǎo)RA患者的炎癥反應(yīng)[8]。Mookherjee等[9]報(bào)道，RA患者PBMC中miR-146a和miR-155表達(dá)水平較正常人升高。Filipowicz等[10]報(bào)道，miR-146a在RA患者滑膜成纖維細(xì)胞(RASFs)中的表達(dá)水平高于骨關(guān)節(jié)炎患者。通過(guò)向體外RASFs培養(yǎng)基中添加一系列炎癥因子(IL-1、LPS、TNF-α)模擬RA的炎性環(huán)境，結(jié)果顯示，LPS和IL-1均可誘導(dǎo)miR-146a上調(diào)。由此推測(cè)，RA患者中可能由于發(fā)炎的滑膜中存在前炎癥細(xì)胞因子和趨化因子而導(dǎo)致miR-146a水平表達(dá)升高，miR-146a上調(diào)可能又通過(guò)核因子κB(NF-κB)通路，誘導(dǎo)各種促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-17等的分泌，或者刺激Th1細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、IL-12、IFN-γ等，從多條通路促進(jìn)RA的炎癥發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，miR-146a在RA患者PBMCs中的表達(dá)水平高于對(duì)照組，與以往研究結(jié)果相符。提示miR-146a具有作為診斷RA生物標(biāo)志物的潛能。

TwHF的主要有效成分是雷公藤甲素。研究顯示，雷公藤甲素可以降低免疫功能或宿主防御相關(guān)基因的表達(dá)，例如促炎細(xì)胞因子和趨化因子，包括TNF-α、IL-1β、CCL-1、CCL-2等。此外，既往研究表明，細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)、層粘連蛋白等黏附分子以及NF-κB、激活轉(zhuǎn)錄因子3(ATFA3)等轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5(STAT5)也能被TwHF抑制[11]。研究發(fā)現(xiàn)，RA患者接受TwHF治療后，miR-146a表達(dá)水平降低，且疾病活動(dòng)減弱[12]。另有研究顯示，接受抗TNF藥物治療的RA患者和未接受抗TNF藥物治療的RA患者的miR-146a表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[6]。Abou-Zeid等[13]認(rèn)為，其原因可能是抗TNF治療反應(yīng)未完成，或者是僅一小部分患者對(duì)治療有應(yīng)答。本研究結(jié)果顯示，TwHF治療可降低RA患者PBMC中miR-146a的表達(dá)水平。其原因可能是TwHF通過(guò)抑制RA患者NF-κB的表達(dá)，依賴NF-κB上調(diào)的miR-146a通路被阻斷，致使miR-146a表達(dá)下調(diào)或無(wú)法上調(diào)，從而減少炎性因子的分泌，進(jìn)而達(dá)到緩解RA的作用。

關(guān)于miR-146a表達(dá)水平對(duì)TwHF治療RA應(yīng)答的影響目前研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，臨床應(yīng)答者基線期miR-146a表達(dá)水平高于臨床不應(yīng)答者，提示miR-146a表達(dá)水平升高可能影響TwHF治療RA的臨床應(yīng)答。其可能原因有：①miR-146a是一個(gè)很強(qiáng)的促炎因子，其含量越高表明患者炎癥越重，疾病活動(dòng)度越高。因此，疾病活動(dòng)度高的RA患者有更大的DAS28下降空間，更容易達(dá)到臨床應(yīng)答。②miR-146a高表達(dá)可能與患者對(duì)TwHF治療的敏感性有關(guān)，但目前尚無(wú)研究證明，需要我們進(jìn)一步研究觀察。單因素Logistic回歸顯示,miR-146a和CRP與臨床應(yīng)答均有關(guān)聯(lián)，因此在多因素Logistic回歸時(shí)兩者可能相互干擾，未得到miR-146a對(duì)RA患者TwHF治療應(yīng)答的獨(dú)立相關(guān)作用。

本研究存在一定的局限性：①本研究中RA患者在接受TwHF的同時(shí)合用MTX或LEF進(jìn)行治療，這對(duì)結(jié)果可能存在干擾。但本研究入組患者為經(jīng)單獨(dú)使用MTX或LEF治療效果不佳的患者，因此其聯(lián)合使用對(duì)研究結(jié)果影響較小，并且我們采用了單因素及多因素回歸分析來(lái)排除MTX或LEF聯(lián)用對(duì)結(jié)果的干擾。②本研究樣本量相對(duì)較小，僅納入62例患者，因此缺乏統(tǒng)計(jì)效能。③本研究隨訪周期較短，因此miR-146a對(duì)TwHF治療RA患者的長(zhǎng)期療效的影響未能評(píng)估。

綜上所述，RA患者PBMCs中miR-146a表達(dá)水平上調(diào)，其基線期表達(dá)水平升高可能影響TwHF治療RA的臨床應(yīng)答。