張杜娟，李麗萍，張蕊，郭瑞臣

(1濟南市婦幼保健院，濟南250001；2山東大學(xué)齊魯醫(yī)院)

疫苗接種是預(yù)防傳染病的有效手段，可分為病毒疫苗、DNA疫苗和細菌疫苗。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，疫苗的劑型、接種方式等不斷改進，無針接種技術(shù)已成為研究熱點。經(jīng)皮免疫(TCI)屬于無針接種，系局部應(yīng)用疫苗抗原和(或)佐劑于皮膚表面，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生系統(tǒng)性免疫反應(yīng)。TCI彌補了傳統(tǒng)接種方式的不足，且不經(jīng)胃腸道降解，作用更持久。微針是TCI中發(fā)展較迅速的一種，是由微細加工技術(shù)制成的具有不同形狀、結(jié)構(gòu)和材料的微米級空心或?qū)嵭尼槪倘肫つw后，在角質(zhì)層形成多個微米級通道，允許大分子藥物或微粒通過。微針細而尖，一般的穿刺深度僅在真皮乳頭層，未接觸到神經(jīng)末梢，屬無痛給藥方式。根據(jù)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的不同，微針可分為實心微針、包衣微針、可溶微針和空心微針。目前微針在TCI和疫苗接種領(lǐng)域的研究已取得較大進展?，F(xiàn)就微針在TCI中應(yīng)用的最新研究進展綜述如下。

1 微針在病毒疫苗中的應(yīng)用

病毒疫苗是最常見的疫苗，已有研究使用微針接種麻疹疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、流感疫苗等病毒疫苗[1～3]。目前，研究廣泛的病毒疫苗主要有減毒疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗及病毒樣顆粒疫苗。

1.1 減毒病毒疫苗 減毒病毒疫苗是致病性減弱或消失的活病毒株，將其接種到身體內(nèi)，會引發(fā)機體免疫反應(yīng)，但不會引起疾病的發(fā)生。常見的減毒疫苗有麻疹疫苗、帶狀皰疹疫苗、黃病毒疫苗。但是，減毒疫苗是活病毒株，在實際接種中仍有一定的風(fēng)險。對于嬰兒、孕婦、老人等免疫力低的人群，減毒疫苗可誘發(fā)嚴重疾?。徊糠譁p毒疫苗易恢復(fù)致病性，如口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗變異后易產(chǎn)生神經(jīng)毒性，進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起癱瘓；另外，減毒疫苗在高于8 ℃環(huán)境中不穩(wěn)定，需低溫運輸，運輸成本較高[4]。

研究表明，微針接種減毒疫苗既可產(chǎn)生較強的免疫反應(yīng)，又能提高疫苗的穩(wěn)定性。Dean等[5]使用微針將乙型腦炎病毒減毒疫苗接種于靈長類動物，結(jié)果顯示，相較皮下注射，微針接種后體內(nèi)抗體滴度高，病毒血癥持續(xù)時間長，免疫反應(yīng)更強。Edens等[6]使用可溶微針為恒河猴接種麻疹減毒疫苗，當(dāng)接種相同劑量的疫苗時，微針接種和皮下注射可在恒河猴體內(nèi)誘發(fā)相同的抗體水平；但穩(wěn)定性試驗顯示，同樣在40 ℃條件下保存，液體疫苗7 d失活，凍干疫苗90 d失活，而微針疫苗可保存4個月。同時，有研究發(fā)現(xiàn)，疫苗接種時，皮內(nèi)注射相較皮下注射產(chǎn)生的免疫反應(yīng)強。Beals等[7]選取224例有水痘史的受試者，將不同劑量的減毒皰疹疫苗經(jīng)皮下或皮內(nèi)注射，結(jié)果皮內(nèi)注射劑量為皮下注射的1/3時，卻產(chǎn)生比后者更強的免疫反應(yīng)；當(dāng)皮內(nèi)注射劑量為皮下注射的1/10和1/27時，仍能產(chǎn)生與皮下注射相同程度的免疫反應(yīng)。微針接種屬皮內(nèi)注射，因此可產(chǎn)生較強的免疫反應(yīng)。

1.2 滅活病毒疫苗 滅活病毒疫苗是指先對病毒進行培養(yǎng)，然后用化學(xué)或物理方法將其滅活而制成的疫苗。常見的滅活疫苗有流感疫苗、輪狀病毒疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗(注射)、狂犬病疫苗等。滅活疫苗免疫原性低、接種劑量大、因其不會恢復(fù)致病性，較減毒疫苗安全。

最新研究顯示，使用微針接種滅活病毒疫苗，疫苗穩(wěn)定性高，機體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)強。Chu等[8]發(fā)現(xiàn)，滅活流感病毒疫苗的普通液體制劑在非冷藏條件下1～2周即失活，而可溶微針疫苗在4、25、37、45 ℃條件下均可保存3個月。Kim等[9]研究表明，使用包衣微針接種三價流感疫苗可產(chǎn)生長期交叉保護作用，能預(yù)防季節(jié)性流感及新的流感病毒株感染。Schipper等[10]發(fā)現(xiàn)，用空心微針給大鼠分劑量接種脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗，可產(chǎn)生較皮下或皮內(nèi)單劑量接種更強的免疫反應(yīng)。

1.3 亞單位疫苗 亞單位疫苗是通過化學(xué)分解或控制性的蛋白質(zhì)水解方法，提取病毒的特殊蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，篩選出的具有免疫活性的片段而制成的能誘發(fā)機體產(chǎn)生抗體的疫苗。與滅活疫苗相似，亞單位疫苗免疫原性低，安全性高，接種劑量大。常見的有流感病毒疫苗、寨卡病毒疫苗等。

微針接種亞單位疫苗也具有產(chǎn)生免疫反應(yīng)強、疫苗穩(wěn)定性高等優(yōu)點。Kim等[11]用可溶微針接種重組寨卡病毒亞單位疫苗，4周后小鼠體內(nèi)抗體水平保持較高水平，而且免疫小鼠孕育的幼鼠對病毒也有一定免疫性。Koutsonanos等[12]觀察了H1N1流感亞單位疫苗經(jīng)包衣微針接種幼小鼠后引發(fā)的免疫反應(yīng)，結(jié)果顯示，與肌注相比，微針接種產(chǎn)生的抗體滴度更高；同時，微針接種產(chǎn)生的濾泡B輔助性T細胞水平更高，可調(diào)節(jié)B細胞分化為記憶B細胞或效應(yīng)B細胞。Mistilis等[13]發(fā)現(xiàn)，熱穩(wěn)定亞單位流感疫苗在含HEPES、醋酸銨緩沖液及精氨酸等基質(zhì)的制劑中最穩(wěn)定，此制劑的微針產(chǎn)品可在25 ℃條件下保存6個月。另外，微針接種亞單位疫苗時，免疫佐劑的使用也能提高機體免疫反應(yīng)。小鼠試驗顯示，微針接種流感亞單位疫苗時，使用咪喹莫特作為免疫佐劑可提高免疫反應(yīng)[14]。

1.4 病毒樣顆粒疫苗 病毒樣顆粒疫苗是含有某種病毒的一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白的空心顆粒，沒有病毒核酸，不能自主復(fù)制，能引起宿主的免疫反應(yīng)，而不對宿主造成傷害，常見的有流感病毒疫苗。病毒樣顆粒疫苗比其他的病毒疫苗穩(wěn)定，已成為疫苗研究的熱點。

病毒樣顆粒的微針疫苗具有穩(wěn)定性高、機體免疫反應(yīng)強的優(yōu)點。Quan等[15]通過微針為近交雌性小鼠接種H1N1流感病毒病毒樣顆粒疫苗，結(jié)果顯示，海藻糖能提高病毒疫苗穩(wěn)定性，機體可獲得超過1年的免疫力。另一研究顯示，含有流感病毒M2胞外區(qū)的病毒樣顆粒微針貼片中，疫苗室溫條件下可保存8周，同時對H1N1、H3N2和H5N1流感病毒具有交叉保護能力[16]。小鼠試驗顯示，微針接種此疫苗比肌內(nèi)注射引起的免疫反應(yīng)更強。免疫佐劑的使用也能提高機體的免疫性，以鼠傷寒沙門氏菌Ⅰ相鞭毛蛋白為免疫佐劑，微針接種M2病毒顆粒，低劑量接種即可產(chǎn)生比肌內(nèi)注射高劑量疫苗更好的免疫保護效果，與鼻腔免疫效果相當(dāng)[17]。微針接種病毒樣顆粒疫苗已進入臨床試驗階段。美國傳染病研究中心(IDRI)用MicronJet600微針為健康受試者皮內(nèi)接種H5N1病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒以苜蓿植物和吡喃葡萄糖脂質(zhì)A為原料制成，在300例健康受試者中均未發(fā)現(xiàn)嚴重不良反應(yīng)[18]。

2 微針在DNA疫苗中的應(yīng)用

DNA疫苗又稱基因疫苗，是指將編碼某種蛋白質(zhì)抗原的重組真核質(zhì)粒表達載體直接注射到動物體內(nèi)，使外源基因在體內(nèi)表達并產(chǎn)生抗原，激活機體的免疫反應(yīng)，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的體液免疫和細胞免疫[19]。DNA疫苗可經(jīng)肌肉或皮膚接種，轉(zhuǎn)染肌細胞或抗原呈遞細胞等。與傳統(tǒng)疫苗相比，DNA疫苗具有熱穩(wěn)定性好、易于快速大規(guī)模生產(chǎn)和安全性高等優(yōu)勢。目前，正在研發(fā)的乙肝DNA疫苗HEPLISAV-B正在Ⅲ期臨床試驗中，與傳統(tǒng)乙肝疫苗相比，安全性更高，免疫保護更強。

DNA疫苗的接種方式也是研究熱點，研究人員嘗試使用不同類型的微針接種DNA疫苗。Hu等[20]用實心微針接種黑色素瘤DNA疫苗，并考察了DNA疫苗的靶向性、小鼠體內(nèi)抗黑色素瘤治療和預(yù)防免疫效果；結(jié)果顯示，腫瘤生長受到抑制，B16-移植瘤BALB/c小鼠存活時間延長。Kim等[21]用含pH敏感的聚電解質(zhì)多層介質(zhì)的包衣微針接種DNA疫苗，結(jié)果顯示，與傳統(tǒng)的皮下注射相比，微針接種能引起更強的免疫反應(yīng)。Fernando等[22]研制成一種含有密集納米陣列的納米貼片，將流感核蛋白DNA疫苗包衣至納米貼片上，小鼠使用納米貼片經(jīng)皮免疫后，與肌注相比，其體內(nèi)抗體滴度更高，CD8+T細胞反應(yīng)更強。Arya等[23]用可溶微針貼從比格犬內(nèi)耳接種狂犬病DNA疫苗，與同劑量的疫苗肌注相比，產(chǎn)生的抗體滴度相當(dāng)。Yang等[24]發(fā)現(xiàn)，PLGA-聚-L-谷氨酸/聚-γ-谷氨酸納米粒子與埃博拉病毒疫苗通過靜電作用可形成復(fù)合物，將復(fù)合物裝入可溶微針貼片中，接種至小鼠體內(nèi)，能引發(fā)強烈的免疫反應(yīng)。

微針接種DNA疫苗具有操作簡便、無痛、免疫反應(yīng)強、易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點。對于像流感、埃博拉和寨卡病毒等引起的感染性疾病，需要疫苗能快速大工業(yè)生產(chǎn)，而微針和DNA疫苗的結(jié)合是個可能的解決措施。

3 微針在細菌疫苗中的應(yīng)用

目前正在研制的大多數(shù)疫苗針對病毒感染，但也有部分疫苗研究針對細菌感染。大量細菌寄生在人體中，其中多數(shù)是非致病菌，也有部分致病菌，能引起炭疽、破傷風(fēng)、白喉、霍亂、傷寒熱和肺結(jié)核等疾病。目前，已用于人群的細菌性疫苗有卡介苗、百日咳疫苗、破傷風(fēng)類毒素疫苗、霍亂弧菌疫苗等。隨著微針技術(shù)的發(fā)展，采用微針接種細菌疫苗的研究越來越多。

在發(fā)展中國家，產(chǎn)婦和新生兒破傷風(fēng)是分娩過程中引起死亡的重要原因，接種破傷風(fēng)類毒素能有效預(yù)防破傷風(fēng)。Esser等[25]用可溶微針貼片為孕小鼠接種破傷風(fēng)類毒素疫苗，與肌注相比，產(chǎn)生的免疫反應(yīng)更強，孕小鼠存活率更高；母體用可溶微針貼片接種疫苗后，12周齡小鼠體內(nèi)仍可檢測到破傷風(fēng)抗體，當(dāng)用破傷風(fēng)毒素感染時，6周齡小鼠存活率100%?？梢?，用微針接種破傷風(fēng)類毒素疫苗能有效預(yù)防破傷風(fēng)，操作較簡便，具有較好的應(yīng)用可能性。微針和新劑型的結(jié)合也能提高免疫效果。Siddhapura等[26]用實心微針和空心微針為小鼠接種破傷風(fēng)類毒素殼聚糖納米粒，與接種傳統(tǒng)的破傷風(fēng)疫苗相比，小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的IgG和IgG1滴度相當(dāng)，而IgG2a滴度較高，因而產(chǎn)生免疫反應(yīng)更強。新形式的微針給藥系統(tǒng)——點陣輔助粉末經(jīng)皮給藥系統(tǒng)已用于接種卡介苗，體內(nèi)試驗顯示，此種接種方式能產(chǎn)生與皮內(nèi)注射相當(dāng)?shù)目贵w滴度[27]。

微針自90年代出現(xiàn)，就成為經(jīng)皮給藥的研究熱點，本文綜述了微針在病毒疫苗、DNA疫苗、細菌疫苗接種中的研究進展。使用微針接種疫苗有多種優(yōu)勢：首先，微針接種簡單直接，無需專業(yè)訓(xùn)練，普通人即可給藥；其次，微針細而短，接種疫苗時僅刺穿到真皮乳頭層，不觸及其中的神經(jīng)和毛細血管，不帶來疼痛；再次，干包衣微針疫苗運輸不需要昂貴的冷鏈系統(tǒng)，降低了運輸成本；最后，微針接種節(jié)省劑量，微針直接將疫苗接種至富含抗原呈遞細胞的表皮層和真皮層，可產(chǎn)生比肌注更強烈的免疫反應(yīng)。但是，目前尚無上市銷售的疫苗微針產(chǎn)品，發(fā)展最快的仍處于臨床試驗階段。相信隨著微針技術(shù)的不斷發(fā)展以及臨床研究的不斷深入，微針疫苗將逐步進入市場，成為未來TCI的新方式之一。