趙立新,辛瑞強,李勝利,胡志偉,劉連杰,阿斯根,薩其日拉圖

(內蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 肝膽外科,內蒙古 呼和浩特010017)

過去幾十年,胰腺癌的發(fā)病率逐年上升,胰腺癌具有高度侵襲性,預后較差,發(fā)病率與死亡率基本相當,在世界范圍內也是最具挑戰(zhàn)的惡性腫瘤[1,2]。性別、年齡、吸煙、肥胖、糖尿病可能與胰腺癌發(fā)病有關,但確切病因仍不清楚。近來MiR-21在基因調節(jié)及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中受到廣泛的關注,在直腸癌、胃癌、乳腺癌及肺癌報道較多[3-6]。本研究擬選取胰腺導管腺癌細胞為研究對象,探討miR-21、Bcl-2、C-myc及PTEN在胰腺導管腺癌癌細胞內表達情況,闡明miR-21在胰腺導管腺癌中的可能發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1臨床資料收集我院2012年12月-2015年12月胰腺導管腺癌的組織學標本共38例,以及正常胰腺組織12例,組織標本離體后立即放在液氮中保存。所選手術病例術前均未接受過放療、化療及生物治療,所有病例均簽署知情同意書。38例標本男性25例,女性13例；年齡在42-79歲,中位年齡62.5歲；腫瘤位于胰頭部的25例,腺尾部13例。胰腺癌病理分期參照2010年的胰腺癌UICC/AJCCNM分期標準。

1.2主要實驗試劑Bcl-2抗體、c-Myc抗體、PTEN抗體(p-actin Abeam公司),Taq MicroRNA Reverse Transcription (ABI公司),Trizol Reagent(Invitrogen公司),EDTA(美國Promega公司),羊抗鼠二抗(美國Jackson公司),ABC試劑盒和DAB試劑盒(美國Vector公司),DYY6B電泳儀(美國Bio-Rad公司),超低溫冰箱(日本三洋公司),熒光定量PCR儀及分析軟件(美國ABI),FluorChem 9000凝膠成像系統(tǒng)(美國Alpha Innotech公司),ambda 35紫外/可見光分光光度計(Perkin Elamr公司)。

1.3Real-timePCR檢測mRNA表達水平收集患者胰腺導管腺癌組織標本及癌旁配對的正常胰腺組織樣本,提取mRNA,分光光度計分析總RNA純度和濃度,通過瓊脂糖凝膠電泳分析總RNA的完整性。按照Takara公司逆轉錄試劑盒提供的操作程序進行逆轉錄反應生成cDNA。按照Takara公司逆轉錄試劑盒提供的miR-21通用引物及內參U6和PTEN、Bcl-2和c-Myc的引物及內參β-actin,使用ABI7300Real-timePCR系統(tǒng)對上述檢測指標(miR-21、PTEN、Bcl-2和c-Myc)進行相對定量分析。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。設定程序為： 1)52℃反應1 min；2) 92℃反應5 min；3) 92℃反應10 sec；4) 56℃反應50 sec；5)重復步驟第3)到第5)一共40個循環(huán)。結果計算：2-ΔCt表示real-time PCR相關目的基因在組織的表達水平。

1.4Western-blot法檢測蛋白表達提取收集的胰腺癌組織及正常胰腺組織總蛋白,按試劑盒操作要求,經PAGE電泳分離、轉膜、封閉及PTEN、Bcl-2以及c-Myc 抗體雜交,然后用化學發(fā)光顯色鑒定,再用凝膠成像系統(tǒng)成像。計算目的蛋白相對表達量(目的條帶的灰度值/同一樣本內參的灰度值)。

1.5統(tǒng)計學處理采用配對T檢驗檢測胰腺癌組織與癌旁組織的目的基因平均表達水平,χ2檢驗檢測各基因相對表達水平與胰腺臨床病理特征之間的相互關系,P<0.05表示差 異具有統(tǒng)計學意義,統(tǒng)計采用SPSS15.0軟件包。

2 結果

2.1miR-21在胰腺導管腺癌組織中的表達分別提取胰腺導管腺癌組織、正常組織總RNA,利用QRT-PCR法檢測miR-21的表達情況,在胰腺導管腺癌組織樣本中miR-21的平均相對表達量為3.37±0.25,正常胰腺組織中其平均相對表達量為0.74±0.07,胰腺導管腺癌組織樣本中miR-21的平均表達水平要明顯高于正常胰腺組織樣本的平均表達水平(P<0.05),具有統(tǒng)計學意義。

2.2PTEN蛋白在胰腺導管腺癌組織中的表達與正常組織中表達量比較,Western blot分析顯示PTEN蛋白在胰腺導管腺癌組織表達顯著下降,差異顯示具有統(tǒng)計學意義(0.87±0.032,0.54±0.024，P<0.05)。 見圖1。

2.3Bcl-2蛋白在胰腺導管腺癌組織中的表達與正常對照組相比,Bcl-2蛋白在胰腺導管腺癌組織的表達顯著增加,差異具有統(tǒng)計學意義(0.12±0.014,0.39±0.031,P< 0.05)。見圖2。

2.4c-Myc蛋白在胰腺導管腺癌組織中的表達與正常胰腺組相比,c-Myc蛋白在胰腺導管腺癌組織的表達顯著增加,差異顯示具有統(tǒng)計學意義(0.054±0.003,0.21±0.020,P<0.05)。見圖3。

圖1胰腺導管腺癌組織中PTEN蛋白的表達差異圖2胰腺導管腺癌組織中Bcl-2蛋白的表達差異圖3胰腺導管腺癌組織中c-Myc蛋白的表達差異

2.5miR-21、Bcl-2、c-Myc及PTEN表達水平與胰腺導管腺癌臨床病理特征的關系見表1。

表1 miR-21、Bcl-2、c-Myc及PTEN表達水平與胰腺導管腺癌臨床病理特征的關系

3 討論

MicroRNAs是一類大約20個核苷酸組成的非編碼RNA[7,8],參與細胞的分化、增殖、細胞周期和代謝等各種生物過程。更重要的是它能通過激活原癌基因和抑制抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9,10]。miR-21是最常見的與癌癥相關的MicroRNA,先前的研究顯示miR-21在許多癌癥中表達失調,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用[11-13]。miR-21的潛在機制通過作用于PTEN增強腫瘤的侵襲力。本研究通過Real-time PCR法檢測胰腺導管腺癌及對應癌旁組織中miR-21的表達,發(fā)現(xiàn)miR-21在胰腺導管腺癌組織中的表達要顯著高于對應的正常胰腺組織,表明miR-21與胰腺導管腺癌密切相關,參與了胰腺導管腺癌的發(fā)生發(fā)展。

PTEN是一種抑癌基因。在細胞遷移、擴散和侵襲中起著重要作用。能通過負向調節(jié)AKT信號通路[14,15],使AKT信號通路失活,進一步干擾下游眾多的信號通路,從而調控腫瘤的增殖、遷移和侵襲[16,17]。Meng等[18]發(fā)現(xiàn)抑制肝癌細胞中miR-21的表達能提高PTEN的表達。Giovannetti 等[19]報道轉染pre-miR-21能引起PTEN表達的下降。提示PTEN是miR-21的直接靶基因。本研究通過Western-blot方法檢測胰腺導管腺癌組織及胰腺癌旁組織中PTEN蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)PTEN在胰腺導管腺癌組織中的表達下調,表明PTEN參與了胰腺導管腺癌的發(fā)生發(fā)展。

Bcl-2基因為抑癌基因,能夠抑制腫瘤細胞的凋亡,從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。c-Myc基因是一種重要的原癌基因,它促進細胞分裂,本研究結果顯示Bcl-2、c-Myc在胰腺導管腺癌組織中的表達要明顯高于正常胰腺組織,提示Bcl-2、c-Myc與胰腺導管腺癌密切相關,可能通過抑制胰腺導管細胞凋亡、促進其增殖、分化參與胰腺癌的發(fā)病過程。

本研究發(fā)現(xiàn)胰腺導管腺癌組織中miR-21、PTEN、Bcl-2和c-Myc的表達與T分期、淋巴結有無轉移和TNM分期有密切關系。盡管上述四個指標中miR-21、Bcl-2和c-Myc的表達明顯升高,PTEN表達明顯降低。但是在T分期Ⅲ+Ⅳ、存在有淋巴結轉移和TNM分期Ⅲ+Ⅳ胰腺導管腺癌患者的癌組織中,miR-21、Bcl-2和c-Myc的表達升高、PTEN表達降低更加明顯。miR-21和PTEN的表達在腫瘤的大小方面也有這種趨勢。而miR-21、PTEN、Bcl-2和c-Myc的表達在患者的年齡、性別以及腫瘤的部位方面則無這種差別。提示miR-21、PTEN、Bcl-2和c-Myc可能或共同參與胰腺導管腺癌的分化及轉移,與腫瘤的進展程度有關,可以用于胰腺導管腺癌的診斷及預后。

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