李錢峰， 余佳雯， 魯 軍， 熊 敏， 張昌泉， 劉巧泉

(揚州大學農(nóng)學院，江蘇揚州 225009)

水稻是世界上1/2以上人口的主糧，而淀粉是稻米的主要成分，占稻米干質(zhì)量的80%～90%。因此，淀粉的組成、結(jié)構(gòu)和理化特性對稻米的功能和品質(zhì)均有著重要影響。淀粉按功能可以分為瞬時淀粉和貯藏淀粉。瞬時淀粉存在于植物光合組織中，白天積累而夜間降解，作為重要的碳源庫在植物不能進行光合作用時為其提供生長發(fā)育所需的物質(zhì)及能量。貯藏淀粉主要分布在異養(yǎng)型組織中，如根、種子或者塊莖中，能夠長期儲存，其合成的最初底物來自于光合作用合成的蔗糖[1]。貯藏淀粉的一個重要作用是為種子的萌發(fā)提供物質(zhì)和能量。而根據(jù)淀粉的分子結(jié)構(gòu)特征，淀粉分為直鏈淀粉(Amylose)和支鏈淀粉(Amylopectin)這2大類。直鏈淀粉是α-1，4 糖苷鍵連接而成的葡萄糖聚合體，它是一種線性大分子，沒有或很少有分支。支鏈淀粉則是在α-1，4 糖苷鍵連結(jié)葡萄糖殘基所形成的長鏈上再通過α-1，6糖苷分支鍵連接而成的葡萄糖聚合體，分支鏈的數(shù)量變化較大，各分支鏈的長度也不一致，其分子量比直鏈淀粉要大得多[2]。

除此之外，水稻種子也是重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，其休眠和萌發(fā)特性可直接影響水稻的品質(zhì)和產(chǎn)量。如種子一定程度的休眠可以避免成熟時穗萌，減少稻米產(chǎn)量損失和品質(zhì)下降；而水稻種子萌發(fā)為水稻生產(chǎn)的第1步，良好的種子萌發(fā)是水稻幼苗形態(tài)建成的基礎(chǔ)。播種后種子是否能夠順利破土萌發(fā)，以迅速達到早苗、壯苗和全苗的標準，會直接影響到水稻的種用價值和產(chǎn)量，進而關(guān)系到我國的糧食安全。因此，種子的休眠與萌發(fā)研究一直受到國內(nèi)外學者的高度關(guān)注。種子萌發(fā)指種子從開始吸水至胚根突破種皮的一系列有序的生理和形態(tài)發(fā)生過程。種子萌發(fā)受多種內(nèi)在和外部因素的影響，主要包括種子含水量、成熟度、休眠情況、溫度、光照、空氣、植物激素等[3]。植物激素在種子的萌發(fā)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，其中最主要的2種激素是赤霉素(GA)和脫落酸(ABA)，他們互相拮抗調(diào)控種子的萌發(fā)過程[4]。此外，植物激素油菜素內(nèi)酯(BR)在種子萌發(fā)中的作用也有相關(guān)報道，包括BR在種子萌發(fā)階段的生理效應(yīng)和初步的調(diào)控機制[5-7]。但總體而言，有關(guān)BR在種子萌發(fā)中的相關(guān)研究還較少，特別是在單子葉模式植物和重要作物水稻中，BR調(diào)控種子萌發(fā)的效應(yīng)和調(diào)控機理仍不清楚。

BR家族包含幾十種天然油菜素甾醇類物質(zhì)，其中BL是活性最強的一種，因此常用于植物激素的相關(guān)研究中。本研究首先分析了BL處理對水稻種子萌發(fā)的影響，并結(jié)合之前蛋白組學的研究結(jié)果，利用已創(chuàng)建的淀粉合成關(guān)鍵基因啟動子融合GUS報告基因的轉(zhuǎn)基因水稻，研究萌發(fā)階段BL對部分淀粉合成關(guān)鍵基因表達的影響；此外，進一步提取萌發(fā)水稻種子中的淀粉，利用掃描電鏡、傅里葉紅外光譜、X射線衍射等方法分析BL處理對胚乳中淀粉結(jié)構(gòu)和理化特性的影響。相關(guān)研究結(jié)果為后續(xù)深入研究BR通過調(diào)控稻米中淀粉代謝過程來影響水稻萌發(fā)，并進一步解析BR調(diào)控水稻萌發(fā)的分子機制提供了重要信息。

1 材料與方法

1.1 水稻材料及生長條件

本試驗主要以水稻成熟的種子為研究材料開展種子萌發(fā)的相關(guān)研究，具體包括粳稻日本晴、粳稻9983及以其為受體創(chuàng)建的proAGPS1-GUS、proWx-GUS和proSBE1-GUS轉(zhuǎn)基因水稻。試驗材料按照寬窄行種植于揚州大學農(nóng)學院試驗基地，行株距為(25.2 cm+16.2 cm)×12.8 cm，每個小區(qū)2行，每行10株。全生育期灌淺水層，精細管理，嚴格控制病蟲害，至成熟時收獲種子，供后續(xù)萌發(fā)試驗分析。

1.2 水稻種子萌發(fā)試驗

將日本晴、粳稻9983及其相關(guān)的啟動子融合GUS報告基因的轉(zhuǎn)基因成熟種子進行人工去皮，首先用70%乙醇洗2遍滅菌消毒，再用超純水洗2次，之后放于內(nèi)置2層滅菌濾紙的圓形培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿內(nèi)含有1 μmol/L的BL或其溶劑DMSO對照溶液，然后置于28 ℃和70%相對濕度的黑暗環(huán)境下進行萌發(fā)試驗，每隔12 h取樣拍照直至72 h。

1.3 GUS活性測定

待啟動子融合GUS基因的轉(zhuǎn)基因水稻種子萌發(fā)72 h后，收取材料用于GUS熒光定量測定，測定方法參照Jefferson等的方法[8]進行，總蛋白含量的測定按照Bradford的方法[9]進行。

1.4 稻米淀粉提取

待日本晴種子萌發(fā)36 h后，收取材料用于淀粉提取及后續(xù)淀粉的理化特性分析。為減少堿法提取過程中對淀粉結(jié)構(gòu)的破壞，本試驗中稻米淀粉的提取采用濕磨法結(jié)合中性蛋白酶的方法，在參考Zhu等的方法[10]基礎(chǔ)上加以改進，具體方法為稱取10.0 g精米并加入適量體積的堿水(pH值8.0～8.5)，室溫下浸泡過夜后，倒去浮液，加入1倍固體體積的0.001 mol/L NaOH溶液，用組織勻漿機攪勻后再加入約1倍固體體積的0.001 mol/L NaOH溶液，用1 mol/L NaOH調(diào)pH值到9.5，向勻漿液中加入0.5 g的堿性蛋白酶，于42 ℃下磁力攪拌18 h。消化過的勻漿液過200目篩，并以3 600g離心20 min，用去離子水懸浮沉淀，并再次以3 600g離心20 min。重復(fù)上述清洗過程3次以去掉淀粉中殘留的離子，最后用95%乙醇洗3次，40 ℃烘干后用塑料袋密封放置于4 ℃冰箱備用。

1.5 淀粉顆粒顯微結(jié)構(gòu)觀察

采用Philips XL30ESEM環(huán)境掃描電鏡對淀粉顆粒形態(tài)進行觀察。首先進行樣品的前處理，即將淀粉顆粒樣品用無水乙醇單層分散于樣品盤上，用IB-5離子濺射器(Eiko Co.，日本)處理30 min，鍍一層Pt金離子，之后用環(huán)境掃描電鏡將樣品置于不同放大倍數(shù)下拍照。

1.6 淀粉X-ray晶型分析

X-射線衍射(X-ray powder diffraction，XRD)是研究晶體三維結(jié)構(gòu)幾何性質(zhì)與分子本身性質(zhì)最有用的技術(shù)之一。本試驗材料的X-衍射圖譜是利用多晶X-射線衍射儀(德國布魯克AXS公司，D8-ADVANCE)得到的。淀粉樣品在室溫環(huán)境下平衡24 h后再進行分析。衍射儀操作參數(shù)為40 mA和45 kV，衍射角(2θ)的掃描范圍為4°～40°，每0.2 s掃描0.1°。晶體峰和總的衍射面積通過機械極差求積法(mechanical polar planimeter)求得，結(jié)晶度用晶區(qū)面積占總面積的百分比表示。

1.7 淀粉傅里葉紅外光譜分析(ATR-FTIR)

將淀粉粉末置于盛有飽和氯化鈉水溶液的密閉容器中，吸水7 d處理，隨后將樣品加到OMNI采樣器中，利用ATR支架，對淀粉樣品進行全反射光譜掃描，掃描波數(shù)范圍為 4 000～800 cm-1，分辨率為4 cm-1，采用DTGS檢測器，以去離子水為空白掃背景，掃描累加64次。利用FTIR附帶的軟件分析波譜。首先選取波數(shù)為1 200～800 cm-1區(qū)域的譜圖，調(diào)整基線，設(shè)置半峰寬為19 cm-1，增強因子為1.9對選取的波譜進行去卷積，獲得去卷積波譜。利用Origin 6.0軟件對波譜作圖，測定1 047 cm-1、1 022 cm-1和995 cm-1各峰頂點到基線的高度(即峰強度)，計算1 045 cm-1/1 022 cm-1和1 022 cm-1/995 cm-1的峰強度比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 BL處理對水稻萌發(fā)的影響

種子的萌發(fā)伴隨著種子不斷吸水，打破休眠的種子在鮮質(zhì)量、萌發(fā)率、胚根胚芽等方面都有變化。種子的萌發(fā)總體而言可以分為3個階段，第1個階段(前20 h)為快速吸脹吸水階段，表型上看不出明顯變化；第2階段(20～50 h)為代謝再激活階段，各種代謝過程活化并伴隨著胚芽鞘的出現(xiàn)和伸長；第3階段(50 h以后)為另一個快速吸水的生長吸水階段，伴隨著胚根的出現(xiàn)[11]。為了檢測在萌發(fā)過程中施加BL對水稻種子萌發(fā)的影響，分別用1 μmol/L的BL溶液和相應(yīng)的DMSO對照溶液處理日本晴種子，從0 h到72 h，每隔12 h拍照記錄萌發(fā)情況，至72 h已可明顯觀察到突出的胚根、胚芽鞘，此時進一步測量其長度。結(jié)果如圖1所示，萌發(fā)前24 h 這2種處理的種子均無明顯變化，36 h后種子的胚吸水脹大，胚芽鞘開始出現(xiàn)；隨后胚芽鞘進一步突出伸長，至72 h種子的胚根出現(xiàn)，且總體而言DMSO對照溶液處理的胚根長度極顯著長于BL處理組。測量萌發(fā)72 h種子的胚芽胚根，結(jié)果顯示，BL處理與對照間胚芽的長度沒有顯著差異，但DMSO處理的胚根長度極顯著長于BL處理，推測可能是因為 1 μmol/L 的BL相對于種子胚根而言濃度過高，對其伸長具有抑制效應(yīng)。高濃度BL對根伸長的抑制效應(yīng)在雙子葉模式植物擬南芥中也有報道。Tanaka等研究顯示1 μmol/L的BL促進擬南芥幼苗的下胚軸伸長，但顯著抑制根的伸長，根的長度僅為對照組的30%左右[12]，本研究與其結(jié)果類似，說明根對BL處理更加敏感。

2.2 BL處理對幾個淀粉合成關(guān)鍵基因表達的影響

為鑒定水稻種子萌發(fā)過程中BR對胚中蛋白表達的調(diào)控，進而解析BR調(diào)控種子萌發(fā)的分子機制，前期以BR合成抑制劑BRZ處理的日本晴種子及BR不敏感突變體d61種子為研究材料，利用iTRAQ蛋白組學的方法鑒定萌發(fā)種子胚中受BR調(diào)控的目標蛋白[13]。研究結(jié)果顯示在受BR通路調(diào)控的目標蛋白中包括3個參與淀粉代謝的關(guān)鍵酶，分別為Wx、SBE1和AGPS2，且3個酶的表達在BR合成缺失和BR信號通路受損的水稻種子中均明顯降低(圖2-A)。之前筆者創(chuàng)建了一批淀粉合成關(guān)鍵基因啟動子融合GUS報告基因的轉(zhuǎn)基因水稻，其中正好包括Wx、SBE1和AGPS2的同工酶AGPS1。因此，利用這些水稻材料進一步研究BL處理如何影響這些基因在胚乳中的表達。GUS定量分析結(jié)果顯示，總體而言Wx基因在萌發(fā)種子胚乳中的表達量最高，SBE1基因表達最低。BL處理與對照組的比較結(jié)果顯示，BL明顯抑制Wx基因的表達，僅為對照處理的50%左右；而BL對SBE1表達沒有明顯影響，但BL可明顯誘導AGPS1基因的表達(圖2-B)。通過比較本研究結(jié)果與之前的蛋白組學結(jié)果可知，抑制BR合成或信號傳導可一致性降低這3個酶在胚中的表達，而胚乳中BL處理對這3個基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控則不同于之前的研究，AGPS1的表達明顯上升，而Wx表達明顯下降，SBE1表達變化不明顯，推測可能是因為表達檢測的組織不同(胚乳和胚)，研究表達調(diào)控的水平也不一樣(轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平)。該結(jié)果表明，在種子萌發(fā)過程中BR可在不同表達水平、不同組織中特異性地調(diào)控稻米淀粉代謝，其具體的分子機制還有待于進一步研究。

2.3 BL處理影響稻米淀粉的理化特性

上述結(jié)果已明確BR可通過調(diào)控淀粉代謝相關(guān)基因的表達來影響種子的萌發(fā)，本研究進一步從淀粉的理化性質(zhì)層面分析BL處理對稻米淀粉代謝的影響。選取處于萌發(fā)第2階段(36 h后)經(jīng)BL和對照溶液處理的日本晴種子，利用改進的淀粉提取方法分別提取其胚乳中的淀粉，并進行環(huán)境掃描電鏡(SEM)觀察，以初步確定種子萌發(fā)初期BL處理對淀粉粒形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響?？傮w而言，BL處理的水稻種子近1/2淀粉顆粒表面仍比較光滑，其余淀粉顆粒表面已初步降解，形成較明顯的孔洞；而對照組中，淀粉顆粒表面開始降解形成孔洞的比例要明顯高于BL處理組(圖3)，至少表明在種子萌發(fā)初期BL處理可以影響水稻胚乳中淀粉顆粒的降解速度。

為探究BL處理是否影響稻米淀粉的精細結(jié)構(gòu)，進一步分析了2組材料中淀粉的結(jié)晶度和有序結(jié)構(gòu)。淀粉顆粒結(jié)構(gòu)包括結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)，其中結(jié)晶區(qū)主要是由支鏈淀粉分子以雙螺旋結(jié)構(gòu)組成，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易受外力破壞；無定形區(qū)由直鏈淀粉分子組成，結(jié)構(gòu)較為松散，易為外力和化學組分破壞[14]。目前XRD技術(shù)是一種比較成熟的測定晶體類型并計算結(jié)晶度的方法，其操作易行，結(jié)果可靠。本研究的XRD結(jié)果如圖4所示，供試樣品的結(jié)晶度數(shù)據(jù)表明，BL處理樣品的結(jié)晶度明顯高于對照組(表1)。

用傅里葉紅外光譜儀對淀粉的短程有序結(jié)構(gòu)進行衰減全反射分析。通過設(shè)置增強因子對原始數(shù)據(jù)進行去卷積處理后得到圖5。研究表明，波譜中1 045 cm-1/1 022 cm-1和 1 022 cm-1/995 cm-1峰強度比值被看作是淀粉有序結(jié)構(gòu)的指標，其比值越大，有序程度越高 。計算結(jié)果如表1所示，結(jié)果顯示BL處理樣品的1 022 cm-1/995 cm-1峰強度比值顯著高于對照樣品。上述結(jié)果表明BL處理樣品中淀粉保持著更好的結(jié)晶度和更加有序的結(jié)構(gòu)，暗示在萌發(fā)過程中胚乳淀粉降解較慢，可能是導致萌發(fā)早期種子胚根生長較緩慢的原因之一。

表1 淀粉的相對結(jié)晶度和紅外光譜特性

注：每個數(shù)值進行3次重復(fù)，數(shù)據(jù)為平均值±標準差；“**” 表示數(shù)值與對照組有極顯著差異(P<0.01)；“*”表示數(shù)值與對照組有顯著差異(P<0.05)。

3 討論

研究種子萌發(fā)的調(diào)控機理、提高生產(chǎn)中種子的萌發(fā)率和萌發(fā)勢一直是植物種子研究的重點。種子萌發(fā)過程受多種內(nèi)在和外在因素的影響和調(diào)節(jié)，其中包括植物激素。BR是一種重要的甾醇類植物激素，參與植物生長發(fā)育諸多過程的調(diào)控。目前，對于BR的合成與降解、生理效應(yīng)、參與環(huán)境脅迫的作用、信號傳導通路的解析等研究均取得了顯著進展，但關(guān)于BR調(diào)控植物種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)建成的機理研究還較少，大部分分子機制仍然未知。

同時，淀粉作為重要作物水稻種子的最主要成分，其積累、組成和結(jié)構(gòu)對稻米的產(chǎn)量和品質(zhì)有著重要的影響。已有研究結(jié)果表明，BR參與了植物的淀粉代謝過程。在擬南芥中，BR合成基因CPD的反義轉(zhuǎn)基因材料和BR合成缺陷型突變體cbb1葉片中的淀粉含量均顯著下降[15]。Oh等研究結(jié)果顯示，在BR不敏感型突變體bri1-5中過表達野生型和改造過的(Y831F)BR受體基因BRI1均能提高葉片中的淀粉含量[16]。除擬南芥外，其他植物中的相關(guān)研究也證明BR能夠影響植物的淀粉代謝。在黃瓜中，外源噴施BR能夠顯著提高黃瓜葉片中蔗糖和淀粉的含量[17]。在水稻中，于抽穗前期及抽穗期噴施BR使得水稻葉鞘和莖稈中的淀粉含量有所減少，而種子中的淀粉含量有明顯增加[18]。Wu等利用組織特異性啟動子在水稻根、莖、葉中超表達來源于擬南芥、玉米和水稻的C-22 羥化酶基因來增加BR的合成，對轉(zhuǎn)基因水稻的分析結(jié)果顯示，水稻劍葉中葡萄糖含量提高，水稻種子中葡萄糖轉(zhuǎn)化成淀粉的過程增強[19]。這些試驗結(jié)果表明，BR確實能夠影響植物的淀粉代謝過程，能促進植物葉片和種子中淀粉的積累。除了種子發(fā)育過程中涉及到淀粉的合成與積累，種子萌發(fā)過程中的淀粉代謝也是一個重要環(huán)節(jié)，但目前有關(guān)BR如何通過影響淀粉的代謝從而調(diào)控種子的萌發(fā)仍然未知。

本研究通過BR處理萌發(fā)階段的種子，一方面研究BR對淀粉代謝過程中關(guān)鍵基因的表達調(diào)控，明確BR在種子胚和胚乳中對Wx、SBE1等目標基因具有不同的調(diào)控模式，進一步明確植物激素對植物生長發(fā)育的調(diào)控具有組織特異性，其潛在的調(diào)控機制也可能不同；另一方面，通過掃描電鏡(SEM)觀察、XRD波譜分析等方法研究了BR處理對稻米淀粉的降解速率、淀粉結(jié)晶度和有序結(jié)構(gòu)的影響，表明BR在種子萌發(fā)初期發(fā)揮著作用，對淀粉的降解過程具有明顯影響。該研究結(jié)果與Han等研究結(jié)果較為一致，其蛋白質(zhì)組學研究結(jié)果表明，在水稻種子萌發(fā)初期，BR信號傳導途徑中BSK1、BSU1和BIN2這3個關(guān)鍵元件的磷酸化水平有了顯著提高，表明在水稻種子萌發(fā)初期BR信號通路得到加強[20]。本研究相關(guān)結(jié)果為完善淀粉代謝的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了重要信息，也為進一步解析水稻中BR調(diào)控種子萌發(fā)的分子機制奠定了基礎(chǔ)。

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