楊志剛， 孫海燕， 羅 兵， 李晶晶， 周 莉

(常熟理工學(xué)院生物工程系，江蘇常熟 215500)

水稻雄性不育是在其有性繁殖過程中不能產(chǎn)生正常雄配子的現(xiàn)象，廣泛存在于開花植物中[1]。水稻雄性不育分為2種，一種是細(xì)胞質(zhì)雄性不育；另一種是細(xì)胞核雄性不育，由核基因突變產(chǎn)生，它的不育性是受細(xì)胞核控制，在植物中是比較普遍的，多為隱性細(xì)胞核不育。細(xì)胞核不育性徹底、穩(wěn)定，有利于縮短育種周期與提高產(chǎn)量[2-4]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞核上的基因，控制雄性器官發(fā)育從而使雄性不育，如TDR、OsAPI5、Udt1、OsMYB80和PTC1等控制絨氈層發(fā)育[5]；OsMSP1控制孢子母細(xì)胞的數(shù)量；PCK、SDS、OsRAD21-3、PAIR2控制同源染色體配對；DPW、CYP704B2、Wda1、OsCP1、AID1等控制花藥小孢子的發(fā)育[6]，若是這些基因缺失或突變，不能產(chǎn)生花粉，從而導(dǎo)致雄性不育。更多雄性不育基因的發(fā)現(xiàn)將有助于更深入了解雄配子體發(fā)育機(jī)制。

本研究對粳稻品種93-63和引04-2雜交后代常農(nóng)粳7號中一個(gè)自然突變的雄性不育材料cnj7進(jìn)行了初步的表型觀察、遺傳性狀分析和分子標(biāo)記定位，為該基因的精細(xì)定位、克隆及其功能研究與利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水稻雄性不育突變體材料cnj7來源于一個(gè)93-63/引 04-2 雜交組合后代的自然突變體。其他野生型水稻材料明恢86 和R1128由常熟市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。

1.2 突變體形態(tài)觀察及花粉育性鑒定

取突變體穎花做解剖鏡和半薄切片形態(tài)觀察；取花藥搗碎用1% I2-KI染色觀察，根據(jù)花粉粒形態(tài)和染色狀況分析花粉育性及敗育類型[7]。

1.3 突變性狀的遺傳

群體構(gòu)建[8]：2014年在常熟以cnj7突變體為母本，分別與明恢86和R1128雜交，在海南三亞種植F1并套袋自交，2015年在常熟種植F2。同時(shí)利用其與明恢86和R1128雜交衍生的F1作為父本與突變體測交，在常熟種植回交一代的植株，成熟時(shí)以群體為單位分析單株突變性狀分離的情況，進(jìn)行遺傳分析。

1.4 基因定位

1.4.1 作圖群體 以組合cnj7/明恢86的F2群體作為該基因的定位群體，其中含有突變型單株112株，收集不育株，提取DNA。

1.4.2 水稻DNA的提取[9]將少許新鮮水稻葉片在液氮環(huán)境下磨碎倒入1.5 mL EP管中，加入650 μL CTAB，EP管放入65 ℃恒溫水浴30 min，加入650 μL氯仿，劇烈振蕩 30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液，加入2倍體積無水乙醇，-20 ℃靜置1～2 h，再12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入500 μL 70%乙醇，洗去CTAB，干燥后加200 μL ddH2O溶解DNA，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 SSR分析 微衛(wèi)星引物分析[10-14]：以均勻分布于水稻染色體上的216對微衛(wèi)星引物[序列由康乃爾大學(xué)公布，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成]篩選親本，差異標(biāo)記分別在由cnj7、明恢86、3株可育株、3株不育株構(gòu)成的小群體中進(jìn)行連鎖分析。對小群體得到的連鎖標(biāo)記進(jìn)一步在所有的不育單株中進(jìn)行連鎖驗(yàn)證和分析。

PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系總體積20 μL，包括10.8 μL ddH2O、2 μL buffer、2 μL dNTP、2 pmol SSR、前后引物各1 μL、1 μL DNA模板、0.2 μLTaqDNA聚合酶、2 μL 50%甘油；擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性20 s，52 ℃退火20 s，72 ℃ 延伸20 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min；12 ℃保存。

電泳：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入10 μL Loading Buffer，沸水浴 10 min 后冰浴10 min，垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，1×TBE緩沖液，電壓220 V電泳2～3 h。

染色：染色液1 g/L的AgNO3，顯色液NaOH、Na2CO3、甲醛混合液。可見光下記錄電泳分離結(jié)果。

1.5.4 遺傳作圖 在凝膠電泳分離結(jié)果中將具有明恢86帶型的單株標(biāo)記為“1”，具有cnj7突變體帶型的單株標(biāo)記為“2”，具有二者雜合帶型的單株記為“3”，利用Mapmaker 3.0軟件對分離群體的不育性狀和分子標(biāo)記的分離數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖分析，并進(jìn)行遺傳圖距(cM)的計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體形態(tài)及花粉育性

由圖1可知，突變體植株整體及抽穗情況與正常植株無明顯差異性(圖A、圖B)。突變體最顯著的特點(diǎn)是不育，套袋自交的結(jié)實(shí)率接近于0%，自然環(huán)境下，異花授粉結(jié)實(shí)率低于8%。突變體小花解剖觀察發(fā)現(xiàn)，雌蕊形態(tài)數(shù)目與正常材料并無不同，雄蕊數(shù)目也正常；正常植株雄蕊顏色是淡黃色，且長勢飽滿(圖C、圖E)；突變體雄蕊顏色偏白，接近透明，形體萎縮(圖D、圖F)。將花藥搗碎碘染，顯微鏡下觀察，正常植株有染色很深的花粉粒，而突變體染色花粉粒稀少接近于無(圖G、圖H)，花藥內(nèi)沒有成熟花粉，該突變體是雄性不育株。

2.2 突變體半薄形態(tài)觀察

由圖2可知，野生型和突變體在小孢子母細(xì)胞階段沒有明顯變化，小孢子母細(xì)胞呈多面體形，胞質(zhì)濃厚，藥壁4層細(xì)胞分化和花粉母細(xì)胞發(fā)育完成；野生型花粉母細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂；形成胼胝質(zhì)包裹的二分體、四分體，絨氈層細(xì)胞空泡化，胼胝質(zhì)壁降解，小孢子從四分體釋放；小孢子體積增大，內(nèi)部空泡增多，小孢子外壁逐漸增厚，經(jīng)2次有絲分裂，形成三孢花粉。而突變體從二分體時(shí)期即表現(xiàn)異常，小孢子個(gè)數(shù)增多，之后內(nèi)容物發(fā)生滲漏并最終導(dǎo)致小孢子降解，不能形成花粉。

2.3 突變性狀的遺傳

表1以突變體cnj7作為母本，分別與R1128、明恢86雜交衍生F2群體，同時(shí)利用cnj7×R1128、cnj7×明恢86的F1與突變體cnj7回交衍生BC1F1代植株，調(diào)查突變體形狀在各種背景下的分離，所有種群F1植株的育性均表現(xiàn)正常，但F2和BC1F1的育性出現(xiàn)分離，這表明育性性狀受核基因控制，不育性狀為隱性性狀。在所有雜交組合衍生的F2群體中，關(guān)于育性性狀的分離均符合3 ∶1 的分離規(guī)律，而在雜交組合的F1植株育性性狀分離則符合1 ∶1的分離規(guī)律，表明該不育性狀為單個(gè)基因控制的隱性突變[18]。

表1 突變性狀在群體中的分離

2.4 cnj7(t)基因的初步定位

以常農(nóng)粳7號、明恢86和雜交F1代構(gòu)成小群體，利用水稻12號染色體上均勻分布的微衛(wèi)星標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)室合成216對標(biāo)記引物在親本cnj7雄性不育突變體和明恢86間篩選具有多態(tài)性差異的標(biāo)記[13]。將篩選出的58個(gè)多態(tài)性SSR標(biāo)記引物分別對所有F2代不育性狀的樣本進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第9號染色體上微衛(wèi)星標(biāo)記的R61552、RM556與突變體基因表現(xiàn)明顯的連鎖現(xiàn)象(圖3)。根據(jù)各標(biāo)記在基因組上的位置，該突變基因被初步定位在第9號染色體的微衛(wèi)星標(biāo)記 R61552～RM556之間，遺傳距離分別為20.6、11.3 cM(圖4)。

3 討論

水稻的雄性不育有2種，一種是細(xì)胞核不育，可穩(wěn)定遺傳；另一種是細(xì)胞質(zhì)不育，可以在某種條件下恢復(fù)育性。根據(jù)不育性狀的表達(dá)規(guī)律將細(xì)胞核不育分為隱性細(xì)胞核不育和顯性細(xì)胞核不育。根據(jù)文獻(xiàn)記載，發(fā)現(xiàn)了大約120種不育基因，細(xì)胞質(zhì)雄性不育的基因有20多個(gè)；其余的屬于細(xì)胞核不育基因，目前已有7個(gè)不育基因在第9號染色體明確并克隆，它們分別是OsDDM1a、OsCesA9、PAIR2、PTC1、OsGEN-L、OsUgp1和Ugp1，并且它們都屬于細(xì)胞核雄性不育；其中，OsDD1a影響水稻基因組的DNA甲基化水平；OsCesA9是纖維素合酶催化亞基，它可能形成一個(gè)纖維素合成復(fù)合體從而參與次生細(xì)胞壁的合成；PAIR2在能夠控制水稻細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)同源染色體的配對；PTC1是一個(gè)控制絨氈層發(fā)育、影響花粉粒形成的關(guān)鍵基因；OsGEN-L在水稻小孢子的發(fā)育初期有重要作用；OsUgp1和Ugp1催化葡萄糖的一系列反應(yīng)[9-12]。

隱性核不育這一類植株有利于改良水稻群種。通過雜交、測交、回交等手段將有利基因集中到一起，表達(dá)出更好的性狀，利用優(yōu)勢改良創(chuàng)造出更為優(yōu)質(zhì)的雜交水稻品種[18]。該研究利用不育突變體cnj7與明恢86雜交衍生分離群體，成功地將cnj7(t)定位在第9號染色體上SSR標(biāo)記RM556～R61552之間，遺憾的是，可能是由于親本遺傳性狀差別并不是很大[9-12]，另外可能是由于標(biāo)記引物的缺陷，并未能更加精確地確定雄性核不育突變基因的位置，所以進(jìn)一步精確定位基因，重要的前提條件是親本間遺傳差異要足夠大、F1植株育性正常的分離群體。目前，我們正在研究配置親緣關(guān)系較遠(yuǎn)、遺傳差異較大的一些雜交組合，期望能夠?qū)崿F(xiàn)對該基因的精細(xì)定位。

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