寧慧宇， 江 敏， 張丙林， 鄒華文

(長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北荊州 434025)

植物轉(zhuǎn)脂蛋白(lipid transfer proteins，簡稱LTPs)是植物體內(nèi)具有結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)脂類功能的一類小分子蛋白。又因其對(duì)各種脂類(如輔酶A、磷脂和脂肪酸等)具有較高的親和力，又被稱為非專一性轉(zhuǎn)脂蛋白(non-specific lipid transfer proteins，簡稱nsLTPs)[1-3]。植物轉(zhuǎn)脂蛋白是一類堿性蛋白，分子內(nèi)部都含有1個(gè)由8個(gè)半胱氨酸組成的保守基序(C-Xn-C-Xn-CC-Xn-CXC-Xn-C-Xn-C)。這8個(gè)半胱氨酸形成4對(duì)二硫鍵，所以轉(zhuǎn)脂蛋白分子具有較高的耐高溫、耐變性等特性[4]。最初根據(jù)分子量大小，植物L(fēng)TPs成員被分為2種類型：Ⅰ型、Ⅱ型[5]。此后，Edstam等根據(jù)半胱氨酸之間的距離、保守內(nèi)含子的位置以及翻譯后糖基磷脂酰肌醇錨(GPI-anchor)的添加與否，把LTPs重新劃分為A、B、C、D、E、F、G、H、J和K型[1]。因?yàn)榫哂心らg轉(zhuǎn)移脂分子的功能，植物L(fēng)TPs最初被認(rèn)為參與生物膜系統(tǒng)的生物合成[6]。然而隨著N-端信號(hào)肽的發(fā)現(xiàn)和胞外定位，使人們開始重新認(rèn)識(shí)LTPs的功能?，F(xiàn)有的研究表明，LTPs涉及植物多種生理過程，包括參與蠟質(zhì)的合成和運(yùn)輸、生殖器官的發(fā)育、提高植物抗性、促進(jìn)細(xì)胞壁的伸長，此外還有調(diào)節(jié)果膠降解活性等[7-9]。其中研究較多的是其在蠟質(zhì)的合成和運(yùn)輸、生殖器官的發(fā)育以及在提高植物抗性中的作用。

在之前的研究中，筆者從玉米中克隆到1個(gè)轉(zhuǎn)脂蛋白家族成員，并命名為ZmLTP3(GenBank登錄號(hào) JX435819.1)，過量表達(dá)ZmLTP3基因的擬南芥表現(xiàn)出明顯的抗鹽性[10]。在美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI)數(shù)據(jù)庫中，ZmLTP3基因上游啟動(dòng)子序列并未測通。為了闡述ZmLTP3基因的作用機(jī)制，本研究克隆并測序ZmLTP3基因上游完整的啟動(dòng)子序列，并對(duì)此序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，擬構(gòu)建融合GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化擬南芥，并對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥純合體株系進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，驗(yàn)證啟動(dòng)子功能。本研究為深入分析ZmLTP3基因的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料擬南芥(Columbia 生態(tài)型)、玉米B73、大腸桿菌菌株 DH5α、農(nóng)桿菌GV3101、植物表達(dá)載體pGreen0029-GUS等，均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.2 方法

1.2.1 啟動(dòng)子克隆及序列分析 利用十六烷基三甲基溴化銨(簡稱CTAB)法[11]提取3葉1心期的玉米葉片基因組DNA。在NCBI網(wǎng)站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下載得到ZmLTP3基因ATG上游 2 881 bp(不包括gap的堿基數(shù))的啟動(dòng)子序列，并在此序列內(nèi)部缺口的兩端設(shè)計(jì)上下游引物，擴(kuò)增完整的啟動(dòng)子序列。上游引物序列為5′-GGCGACTGTGACACTATCC-3′，下游引物序列為5′-AAGTAGGGCTATCGAAACAGG-3′。得到完整序列后，在NCBI網(wǎng)站上比對(duì)測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中序列的異同。在Plantcare網(wǎng)站(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)上預(yù)測測序啟動(dòng)子序列中所含有的順式作用元件。

1.2.2 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化 以測序的啟動(dòng)子序列為模板，在-1 301 bp處設(shè)計(jì)上游引物，擴(kuò)增啟動(dòng)子片段，并將此啟動(dòng)子片段插入到植物表達(dá)載體pGreen0029-GUS中GUS的上游。同時(shí)，也把筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的35S啟動(dòng)子片段插入到上述載體中作為陽性對(duì)照。擬南芥的培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因株系的分子鑒定參考文獻(xiàn)[12]。在GUS基因序列內(nèi)部設(shè)計(jì)1對(duì)引物，用于對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR檢測，上游引物序列為5′-TTCTGATTAACCACAAAC-3′，下游引物序列為5′-CGGTTCGTTGGCAATACTCC-3′。

1.2.3 啟動(dòng)子功能分析 分別取轉(zhuǎn)空載體、35S、ZmLTP3基因啟動(dòng)子載體的陽性植株和野生型擬南芥葉片，參照Gross等的方法[13]進(jìn)行GUS染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmLTP3基因啟動(dòng)子克隆

得到準(zhǔn)確、完整的啟動(dòng)子序列，是啟動(dòng)子功能分析的第1步。但是查詢NCBI數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，ZmLTP3基因起始密碼子ATG上游-1 270 bp處有未測通的缺口，并且序列內(nèi)部含有重復(fù)序列及反向重復(fù)序列(圖1)。為了得到準(zhǔn)確的序列，筆者在距缺口較遠(yuǎn)的位置設(shè)計(jì)上下游引物， 擴(kuò)增此片段。測序結(jié)果表明，從上游引物到ATG只有1 302 bp的距離，而不是NCBI數(shù)據(jù)庫中的2 492 bp (不包括缺口的堿基數(shù))。BLAST結(jié)果表明，測序的啟動(dòng)子序列與網(wǎng)上序列一致性為99%，序列內(nèi)部沒有重復(fù)及反向重復(fù)序列(圖2)。

2.2 ZmLTP3基因啟動(dòng)子序列分析

利用Plantcare網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)，測序序列含有眾多順式作用元件，包括14個(gè)TATA-box，這14個(gè)TATA-box中離ATG最近的位于-149 bp處，離ATG最遠(yuǎn)的位于-1 196 bp處，此外，測序序列中還含有7個(gè)CAAT-box(表1)。除了TATA-box、CAAT-box等啟動(dòng)子必需的元件外，該啟動(dòng)子片段包含許多重要的結(jié)合位點(diǎn)及功能元件，例如參與植物防御和逆境響應(yīng)的調(diào)控元件(TC-rich repeats)、參與脫落酸響應(yīng)的作用元件(ABRE)、參與干旱誘導(dǎo)響應(yīng)的元件(MBS)、參與水楊酸響應(yīng)的元件(TCA-element)、眾多光響應(yīng)元件等。這些功能元件的存在，說明ZmLTP3基因可以響應(yīng)多種逆境脅迫(包括生物逆境以及非生物逆境)的誘導(dǎo)，并且在逆境脅迫中發(fā)揮作用。

表1 ZmLTP3基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件

2.3 ZmLTP3基因啟動(dòng)子的擬南芥轉(zhuǎn)化及鑒定

花苞用浸蘸法轉(zhuǎn)化擬南芥后，收取T0代種子，消毒后播種在含有50 μg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，種子發(fā)芽后，選取正常生長狀態(tài)的幼苗進(jìn)行PCR鑒定。如圖3所示，所選擇的轉(zhuǎn)基因株系在400 bp左右都有1條陽性條帶，而野生型株系的對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果為陰性，表明所采樣的擬南芥植株均為成功轉(zhuǎn)化了的陽性株系，可以用來進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.4 ZmLTP3基因啟動(dòng)子的功能鑒定

在本試驗(yàn)中，分別采取成熟階段的不同擬南芥植株的葉片作為試驗(yàn)材料進(jìn)行GUS染色。如圖4所示，野生型及空白載體轉(zhuǎn)化的擬南芥植株葉片未顯示藍(lán)色，而轉(zhuǎn)35S啟動(dòng)子及ZmLTP3基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系都呈現(xiàn)不均勻的藍(lán)色，且轉(zhuǎn)35S啟動(dòng)子的擬南芥株系染色較轉(zhuǎn)ZmLTP3基因啟動(dòng)子的深，暗示ZmLTP3基因啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度不及35S啟動(dòng)子。

3 討論與結(jié)論

從現(xiàn)有的資料來看，研究者大多集中在對(duì)LTPs生物學(xué)功能的探究，而對(duì)其作用機(jī)制則很少有報(bào)道，尤其是對(duì)其上游的分子調(diào)控機(jī)制也鮮有系統(tǒng)的研究。另外，盡管第1條編碼植物L(fēng)TP的cDNA是從玉米中獲得的，但是之后關(guān)于玉米中LTP基因家族及其功能的研究很少有深入的報(bào)道。本研究通過對(duì)ZmLTP3基因啟動(dòng)子的分析，為進(jìn)一步闡明ZmLTP3基因作用機(jī)制，尤其是其上游調(diào)控機(jī)制打下了基礎(chǔ)。

盡管玉米基因組測序工作的完成給玉米分子生物學(xué)的研究帶來了極大的方便，但是由于玉米基因組結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，尚有一些未測通的片段，這也給相關(guān)工作的開展帶來了諸多不便。例如，本研究中ZmLTP3基因上游的啟動(dòng)子序列就沒有完全測通。本試驗(yàn)以NCBI中公布的ZmLTP3基因上游序列為基礎(chǔ)，在序列的缺口上下游合適位置設(shè)計(jì)引物，成功地克隆了啟動(dòng)子序列，填補(bǔ)了NCBI中此序列的缺口，為其他研究者進(jìn)行相關(guān)研究提供了便利。BLAST結(jié)果表明，克隆序列與NCBI中公布的序列一致性為99%。

Plantcare在線分析表明，測序序列除具有TATA-box及CAAT-box等典型的啟動(dòng)子基本順式作用元件外，還含有多種響應(yīng)生物脅迫及非生物脅迫的元件，暗示ZmLTP3基因可能參與多種逆境脅迫的信號(hào)傳導(dǎo)過程，這也與筆者之前的試驗(yàn)結(jié)果相吻合[10]。為了驗(yàn)證此啟動(dòng)子序列的功能，構(gòu)建植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，GUS染色結(jié)果初步證明所克隆的序列具有啟動(dòng)子功能。進(jìn)一步的研究，如啟動(dòng)子核心序列的鑒定、反式作用因子的篩選及驗(yàn)證等則需要進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

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